细胞焦亡在重要器官缺血再灌注损伤中的研究进展*

仝琳鸽 综述，秦 燕 审校

(大理大学基础医学院生理与病理生理学教研室，云南大理 671000)

细胞焦亡是1种新的细胞死亡方式，于1992年在感染了福氏志贺菌的巨噬细胞中被首次发现[1]，并于2001年首次被提出。细胞焦亡是由Gasdermin(GSDM)介导的程序性细胞死亡，由炎性半胱天冬氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)介导并有大量炎性因子释放。细胞焦亡是1种重要的炎症小体效应机制，它控制炎症小体依赖的细胞因子的分泌，其过度激活诱发的无菌炎症，可致严重的组织器官损伤。焦亡与多种疾病密切相关，广泛参与感染性疾病[2]、动脉粥样硬化[3]、中枢神经系统相关疾病[4]的发生和发展，近年来细胞焦亡及其相关蛋白广泛存在于缺血再灌注损伤(ischemia-reperfusion injury，IRI)过程中，与IRI的发生发展密切相关[5]。IRI的发病机制尚未彻底阐明，目前研究认为主要与自由基的生成增多、钙超载和炎性反应过度激活等有关。IRI引起的组织损伤和器官衰竭是患者术后死亡的主要原因，其可继发于诸多病理过程，如心肌梗死、肝移植、急性肾损伤等因血流恢复而引起的功能代谢障碍及结构损伤。临床治疗既要尽早恢复缺血组织的血流，又要减轻或防止再灌注继发损伤的发生，而目前尚无安全有效的药物来抑制IRI。这是IRI防治中亟待解决的重要问题[6]。本文就近些年关于细胞焦亡在重要器官IRI过程中作用机制的相关研究作一综述，为IRI提供新的治疗思路。

1 细胞焦亡相关蛋白

诱发炎性反应是细胞焦亡不同于凋亡的一大特征，焦亡依赖于Caspase和炎症小体，炎症小体的活化诱导白细胞介素和促炎因子的合成和释放，从而诱发或放大炎性反应。

1.1 炎症小体

炎症小体是由模式识别受体(pattern recognition receptor，PRRs)在细胞质中组装而成的多蛋白复合物，可通过识别病原相关分子(pathogen associated molecular patterns，PAMPs)和非病原相关宿主来源的危险信号分子(danger associated molecular patterns，DAMPs)的信号刺激从而触发细胞焦亡[7]。其在细胞焦亡中起着承上启下的作用，由NOD样受体(NLRs)蛋白承接上游相关活化信号，与凋亡相关斑点蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing，ASC)相互作用，从而招募Caspase-1前体(pro-Caspase-1)进入复合物，组装形成炎症小体作用于炎症细胞因子白细胞介素-1β(IL-1β)、IL-18的前体，使其成熟后裂解并释放，扩大炎性反应。通过激活Caspase-1将焦亡信号传递到下游焦亡执行蛋白，最终诱导细胞焦亡[8]。

1.2 Caspase

Caspase根据其行使功能的不同分成2个大类，即凋亡性Caspase和炎性Caspase。与细胞焦亡相关的主要是Caspase-1、4、5、11，活化的炎性Caspase可特异性切割焦亡的最终执行蛋白Gasdermin D(GSDMD)的铰链区，诱导细胞焦亡。Caspase-3一直被认为是细胞凋亡的标志物，WANG等[9]发现在使用化疗药物治疗时，高表达Gasdermin E(GSDME)的细胞可将肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)诱导的细胞凋亡转化为由Caspase-3切割所致的细胞焦亡。

1.3 Gasdermin(GSDM)家族

Gasdermin家族蛋白最初被鉴定为在皮肤和上消化道高水平表达的蛋白，其家族包括GSDMA、GSDMB、GSDMC、GSDMD和GSDME。其中GSDMD是一种含有487个氨基酸的细胞质蛋白，作为Caspase-1、4、5、11的底物，是焦亡的最终执行蛋白。活化后的炎性Caspase可切割GSDMD，形成C端和N端2个结构域，形成的N端肽段可与细胞膜特异性结合致使细胞膜穿孔，诱导细胞焦亡。此外，ORNING等[10]研究表明，GSDMD活性的调节并不局限于Caspase 1、4、5、11，中性粒细胞弹性蛋白酶和Caspase-8也在Caspase-1、11裂解位点或同一接头中的相邻位点切割GSDMD。

2 细胞焦亡的机制

人和小鼠细胞受到不同的刺激，会以不同的途径启动细胞焦亡[11]。根据所依赖的Caspase的不同，可以把细胞焦亡分为经典和非经典途径。

2.1 经典的细胞焦亡途径

经典的细胞焦亡途径是依赖于Caspase-1的细胞死亡方式。在病原体或炎性因子刺激下，模式识别受体可作为感受器识别信号，促进ASC与pro-Caspase-1结合，形成炎症小体，从而活化Caspase-1[12]。活化的Caspase-1一方面通过切割 GSDMD，形成含有N端活性域的肽段与质膜中的磷酸肌醇和心磷脂结合，有效裂解膜质体，形成质孔膜，破坏细胞离子梯度和渗透压，致使细胞肿胀并最终裂解，释放出炎症性细胞内容物[13-14]；另一方面活化的Caspase-1还可以对 IL-1β和 IL-18 的前体进行切割，使其成熟后裂解并释放，扩大炎性反应[15]。

2.2 非经典的细胞焦亡途径

在非经典的细胞焦亡途径中，革兰阴性细菌释放到细胞质中的脂多糖(LPS)直接与pro-Caspase-4、5、11结合使其活化，从而切割GSDMD，同样形成N端肽段致使细胞膜穿孔，启动细胞焦亡[16]。此外，细胞内LPS诱导Caspase-11活化，导致缝隙连接蛋白1通道裂解，ATP释放使膜通道P2X7开放，K+外排，进而激活含NLR家族Pyrin域蛋白3(NLRP3)炎症小体使Caspase-1活化，从而产生活性成熟的IL-1β，扩大炎性反应引起细胞焦亡[17-18]。

3 细胞焦亡与IRI

IRI是由于恢复某些缺血组织、器官的血液灌注及氧供而加重相应组织或器官功能障碍和结构损伤的1种现象。IRI可继发于许多病理过程，如心肌梗死、缺血性脑卒中等，也会出现在溶栓治疗、器官移植后血流恢复而引起的多器官损伤[19]。研究显示细胞焦亡在IRI中有着至关重要的作用，其炎性反应及相关蛋白与肝、心、肾、脑等重要器官IRI的发生机制密切相关[20-23]。深入研究细胞焦亡对了解IRI的发生机制有着十分重要的生物学意义。

3.1 细胞焦亡与肝缺血再灌注损伤(hepatic ischemia reperfusion injury，HIRI)

HIRI常见于肝脏切除手术、肝移植和休克等疾病中[24]。肝脏枯否(Kupffer)细胞的活化产生一系列炎性因子，成为HIRI中启动细胞焦亡的必要条件[25]。Kupffer细胞的激活在IL-1β的产生中起重要作用，体外单核吞噬细胞暴露于缺氧和复氧后可产生大量IL-1β。而炎症细胞分泌IL-1β在很大程度上依赖于炎症小体的组装和Caspase-1激活。ZHEN等[20]研究提示NLRP3炎症小体参与了小鼠HIRI模型中IL-1β的产生。此外，高迁移率家族蛋白1(high mobility group box-1 protein，HMGB1)作为细胞质信号分子可激活Caspase-1和HIRI的炎性反应，而甘草甜素能直接与HMGB1结合抑制其活性，减少IL-1β的产生从而抑制Kupffer细胞焦亡及HIRI期间的肝组织损伤和中性粒细胞浸润。在缺氧复氧模型中，甘草甜素可抑制Caspase-1的活化和GSDMD的激活，从而抑制炎性反应，减少损伤。ZIYI等[26]研究证明，二十二碳六烯酸可以在体内外通过磷脂酰肌醇-3-羟激酶(PI3K)/蛋白激酶(AKT)通路抑制NLRP3、ASC和Caspase-1的表达及体内炎性因子的产生，表现出抗细胞焦亡能力，保护肝脏免受HIRI。此外，Toll样受体4(TLR4)/核因子-κB(NF-κB)/NLRP3炎症小体通路在HIRI的发病机制中起重要作用，而奥曲肽可通过抑制TLR4/NF-κB/NLRP3炎症小体通路介导的焦亡，减轻过度炎性反应，表现出肝脏保护作用，且奥曲肽(25 μg/kg)较奥曲肽(50 μg/kg)或褪黑激素更有效，加入褪黑激素后，其作用不能通过下调TLR4/NF-κB/NLRP3炎性小体通路而增强[27]。由此可见，炎性因子是HIRI介导细胞焦亡的始动因素，通过抑制其活化，可有效阻断细胞焦亡从而减轻HIRI。在HIRI过程中，不仅有Caspase-1 介导的细胞焦亡经典途径，还会激活依赖Caspase-11的非经典细胞焦亡途径。王小莹等[28]发现HIRI后，Caspase-1和Caspase-11的表达增加，使用异氟醚预处理后可减轻HIRI，而这一作用与细胞焦亡密切相关。FAGENSON等[29]使用缺血预处理(IPC)和后处理(IPO)可诱导经典和非经典炎症调节因子上调。且Caspase 1在HIRI时被激活，Caspase1/Caspase11双基因敲除小鼠HIRI减轻。因此，针对Caspase1/Caspase11的新型治疗药物的开发可能有助于减轻HIRI。但至今，在HIRI过程中细胞焦亡的作用机制还不是很明了，因而从介导细胞焦亡经典和非经典途径的不同靶点出发，对HIRI及机制的探究十分重要。

3.2 细胞焦亡与心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)

MIRI主要与钙超载、自由基及活性氧(ROS)增多、线粒体功能障碍等有关。研究发现[30]，TLR4可被再灌注产生的ROS激活，从而通过TLR4/MyD88/NF-κB/NLRP3通路介导细胞焦亡。木犀草素[31]、大黄素[32]可通过此信号通路来降低细胞焦亡相关蛋白和炎性细胞因子的表达，继而抑制MIRI诱导的细胞焦亡，提高细胞体外存活率，减少心肌缺血的面积，改善心脏功能。ZHEN等[20]证明由ROS介导的NLRP3炎症小体激活引起的细胞焦亡在糖尿病大鼠的炎性反应和MIRI中也有重要作用，抑制NLRP3炎症小体的激活可降低糖尿病大鼠的MIRI。相似的，尿酸促进ROS的生成加重MIRI诱导的NLRP3炎症小体介导的细胞焦亡，导致进一步损伤[33]。此外，炎性反应在MIRI的研究中越来越受关注，细胞焦亡逐渐被认为是MIRI炎性反应的重要调节因子，而缺血再灌注引起的各种刺激可以增强细胞焦亡过程。研究显示β-细辛脑处理后可明显抑制炎性反应，NLRP3炎症小体表达减少，Caspase-1和GSDMD活性降低，心肌细胞焦亡被抑制[34]。而YUE等[35]研究发现，MIRI后心肌细胞中ASC、NLRP3等炎症相关蛋白表达增高；相反，用siRNA沉默钙蛋白酶可抑制NLRP3/ASC/Caspase-1通路的激活，减少小鼠内质网应激，改善了由MIRI引起的心肌功能障碍。天麻素[36]也可通过抑制NLRP3/ASC/Caspase-1通路阻断心脏微血管内皮细胞焦亡，减少炎性细胞浸润。LIN等[37]研究发现，miRNA-149可以通过结合3′-非翻区域(3′UTR)负性调节叉形头转录因子O亚型3(FOXO3)的表达，上调NLRP3、Caspase-1等炎症相关蛋白的表达水平，加重细胞焦亡。而二甲双胍可增强腺苷酸活化的蛋白激酶(adenosine 5′-monophosphate-activated protein kinase，AMPK)通路的激活，抑制NLRP3炎症小体，进而减轻MIRI诱导的炎性反应发挥心脏保护作用[38]。这说明ROS的激活和机体的炎性反应在细胞焦亡中起重要作用，通过对其调控可减轻MIRI，改善心脏功能。

3.3 细胞焦亡与肾缺血再灌注损伤(renal isehemia reperfusion injury，RIRI)

由肾移植、败血症及心脏手术等引起的RIRI是急性肾衰竭(acute kidney injury，AKI)的主要原因[39]。YANG等[21]研究表明在小鼠RIRI模型中细胞焦亡相关蛋白Caspase-1、11及IL-1β的表达增加。同样，缺氧-复氧损伤也会在肾小管上皮NRK-52E细胞中引起细胞焦亡，使膜失去完整性，进而乳酸脱氢酶(LDH)和炎性因子IL-1β释放，扩大炎性反应。此外，内质网应激标志物C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein，CHOP)的表达在RIRI模型中和缺氧复氧处理的细胞发生细胞焦亡之前明显上调，使用siRNA干扰CHOP基因表达，可显著减少NRK-52E细胞焦亡及IL-1β、Caspase-11的生成，减轻中性粒细胞浸润和肾功能损伤，表明RIRI可激活内质网应激相关通路，诱导细胞焦亡。除内质网应激外，还有其他因素也与RIRI介导的细胞焦亡有关。在HK-2细胞缺氧复氧模型和RIRI组织中miRNA-155表达显著增加，并通过下调FOXO3a和下游蛋白Caspase富集功能域的凋亡抑制因子在细胞焦亡中的抑制作用，导致Caspase-1和促炎细胞因子的表达上调，加重肾损伤[40]。TAJIMA等[41]的研究发现，β-羟基丁酸可增加上游FOXO3的表达来抑制细胞焦亡，从而减轻RIRI。RIRI不仅会引起自身的损伤，还会导致远端器官的损伤。 LIU等[42]建立肾缺血再灌注诱导的急性肺损伤(acute lung injury，ALI)模型，发现RIRI可激活肺组织中NLRP3、ASC、Caspase-1等焦亡相关蛋白，引起大量肺损伤和炎性细胞浸润，而异丙酚可显著抑制RIRI所致的ALI和细胞焦亡，上调Sirtuin 1(SIRT1)的表达，减轻RIRI诱导的ALI。ZHAO等[43]利用异体肾移植大鼠模型，证明了肾脏同种异体移植物中缺血再灌注释放的大量组蛋白会与TLR4结合并激活炎症小体，从而引发细胞焦亡，导致急性肝功能损害，血管内皮生长因子可减轻组蛋白诱导的细胞焦亡。以上表明细胞焦亡加重了RIRI，进而导致肾功能严重受损，通过抑制焦亡可减轻肾组织损伤。

3.4 细胞焦亡与脑缺血再灌注损伤(cerebral ischemia-reperfusion injury，CIRI)

CIRI可在多种临床环境下发生，缺血再灌注可诱导炎症小体的活化，这些炎症小体广泛影响神经炎症，进而影响神经元的生存能力[44]。目前，NLRP3炎症小体是神经系统疾病研究最广泛的复合体，缺血再灌注诱导的神经元细胞死亡和神经系统损伤与NLRP3的激活密切相关。Hispidulin通过调节AMPK/GSK3β信号通路抑制NLRP3介导的细胞焦亡，明显改善CIRI后大鼠的神经系统症状，减少梗死面积和神经功能障碍，在体内外发挥神经保护作用[45-46]。据报道，抗癫痫药丙戊酸可明显降低HIR后NLRP3、Caspase-1等炎性因子的表达，抑制体外海马神经元细胞焦亡，减轻认知功能障碍和IRI[43]。腹腔注射吡格列酮[47]可通过激活PPAR-γ抑制HMGB-1/RAGE和RAC1/ROS通路降低ROS水平，ROS水平的降低抑制NLRP3炎症小体和HMBG1/RAGE途径的激活，从而最终抑制促细胞焦亡信号通路，降低大鼠大脑梗死面积，改善神经功能缺损。SHE等[22]通过经典大脑中动脉闭塞建立CIRI模型，结果发现补阳还五汤的活性成分糖苷能抑制CIRI大鼠海马NLRP3和IL-1β等细胞焦亡相关蛋白的表达，从而抑制神经元细胞焦亡而发挥神经保护作用，增加脑缺血再灌注大鼠海马CA1区神经元细胞的存活。SUN等[48]发现CIRI后低密度脂蛋白受体(low-density lipoprotein receptor，LDLR)表达下调，而LDLR基因敲除增加了Caspase-1和GSDMD的激活，并导致严重的神经元细胞焦亡，LDLR的缺乏还导致NLRP3介导的IL-1β和IL-18过度成熟和释放，由此导致了严重的神经缺陷和长期的认知功能障碍。由此可见，细胞焦亡在CIRI过程发挥重要作用，NLRP3炎症小体是细胞焦亡中的关键蛋白，通过抑制其表达可抑制下游焦亡相关蛋白的表达，减少炎性反应进而减轻CIRI。

4 展 望

GSDM介导的细胞焦亡在针对病原体相关分子模式和先天免疫防御中有重要作用。细胞焦亡相关蛋白及途径，与IRI的发生发展密切相关，目前的研究主要集中在焦亡相关成分如NLRP3在各器官IRI中的作用，多数研究表明NLRP3的激活诱导了焦亡，通过抑制细胞焦亡的发生可减轻各重要器官的IRI，但目前对细胞焦亡的研究多数局限于动物及体外细胞水平，焦亡在各个器官是如何引起IRI，它在疾病进展中的作用如何，有关焦亡相关蛋白的抑制剂是否适合临床应用等问题依然不清楚。还需要进行临床试验来分析单独与联合使用焦亡相关抑制剂的效用。因此，对细胞焦亡相关通路的调控和炎性因子的深入探究，可能为细胞焦亡在各重要器官的IRI中机制的阐明及防治措施的探寻提供新思路。