非小细胞肺癌程序性死亡配体1与EGFR基因突变相关性研究

鄢丽敏, 李雪梅, 雷 冲, 闫继东, 张志勇

(河北省唐山市工人医院， 河北 唐山 063000)

2020年中国癌症新发病例457万例，肺癌位居第一位；同年，癌症死亡人数300万，其中肺癌死亡人数遥遥领先，高达71万，占癌症死亡总数的23.8%[1]。我国非小细胞肺癌(Non small cell lung carcinoma,NSCLC)的治疗已逐步从传统放化疗手段向分子靶向及免疫治疗的方向发展，表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor,EGFR)是最重要的肺癌驱动基因，EGFR受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR tyrosine kinase inhibitors,EGFR-TKIs)是EGFR突变型NSCLC患者的精准治疗手段[2]。程序性死亡配体1(Programmed cell death-ligand 1,PD-L1)可与T细胞表面程序性死亡受体1(Programmed cell deaths 1,PD-1)结合，从而抑制活性T细胞对肿瘤细胞的免疫监视。以PD-L1为代表的免疫检查点抑制剂(mune checkpoint inhibitors，ICIs)在NSCLC治疗中取得突破性进展，但国外相关研究却显示ICIs对EGFR突变型NSCLC患者的治疗效果并不理想[3,4]。本研究通过分析PD-L1表达强度与EGFR基因突变率的关系和PD-L1表达与EGFR基因突变状态之间的相关性，以期找到EGFR突变型NSCLC免疫治疗效果差的原因，为EGFR突变型NSCLC患者的精准诊疗提供参考依据。

1 资料与方法

1.1一般资料：收集唐山市工人医院病理科2020年至2021年二年间行EGFR基因突变检测及PD-L1免疫组化染色NSCLC病例共308例，其中包括肺腺癌299例、鳞癌7例、腺鳞癌2例。

1.2PD-L1(22C3)免疫组化染色：石蜡标本制成4μm切片，鼠抗人PD-L1单克隆抗体(克隆号22C3)购自美国丹科北美有限公司(Dako North American,Inc)，经Dako抗体稀释液稀释，工作浓度1∶50，以正常扁桃体组织作为阳性对照，以PBS代替PD-L1抗体作为阴性对照。

1.3PD-L1(22C3)判读标准：对整张切片通过肿瘤比例评分(Tumor Proportion Score,TPS)进行整体评定，任意强度的部分或完全肿瘤细胞膜染色判定为阳性细胞。TPS=PD-L1染色阳性肿瘤细胞数量/肿瘤细胞总数×100。根据TPS得分分组：TPS<1%为阴性，1%≤TPS<10%为弱阳性，10%≤TPS<50%为中等阳性，TPS≥50%为强阳性；将PD-L1阴性及弱阳性表达划分为低表达组，将中等阳性及强阳性表达划分为高表达组。

1.4EGFR基因检测：EGFR基因突变检测在我院病理科分子实验室进行。采用突变扩增阻滞系统(amplification refractory mutation system,ARMS)方法对EGFR基因的18～21号外显子的41种突变类型进行检测。检测选用美国罗氏(Cobas EGFR Mutation Test V2)检测试剂盒，操作严格按照产品说明书进行，应用阴性、阳性及空白对照进行质控。所有标本检测前均进行石蜡包埋切片，并HE染色，进一步评估细胞含量，确保每例标本细胞含量≥100。

1.5统计学分析：采用统计软件SPSS26.0对数据进行统计分析，PD-L1表达情况EGFR基因突变之间的差异性比较采用pearson's χ2检验，相关性分析采用Spearman相关系数；PD-L1表达与EGFR基因突变类型之间的差异性比较采用Fisher精确检验。设定P≤0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1EGFR基因突变检测结果：308例研究对象中有186例存在EGFR基因突变(突变率60.39%)，其中21外显子L858R点突变95例(占突变例数的51.08%)，19外显子缺失突变73例(占突变例数的39.25%)，20外显子插入突变6例，21外显子L861Q点突变5例，18外显子G719X点突变2例，21外显子L859R点突变1例，同时含上述两种突变者4例。见图1。

2.2PD-L1(22C3)表达结果：308例研究对象中，PD-L1表达结果阴性108例(占病例总数的35.06%)，弱阳性106例(占病例总数的34.42%)，中等阳性60例(占病例总数的19.48%)，强阳性34例(占病例总数的11.04%)。见图2。

2.3PD-L1(22C3)表达与EGFR基因突变的相关性：PD-L1阴性、弱阳性、中等阳性和强阳性的病例EGFR突变率分别为71.30%、57.55%、50.00%、44.12%，PD-L1表达强度与EGFR基因突变率之间差异有统计学意义(P=0.017)，并且PD-L1表达强度与EGFR突变率之间呈现较弱的负相关性(r=-0.176，P=0.002)，见表1。EGFR突变型中，PD-L1低表达率和高表达率分别为74.19%和25.81%，EGFR野生型中PD-L1低表达率和高表达率分别为62.30%和37.70%，EGFR基因状态与PD-L1表达强度之间差异有统计学意义(P=0.027)。见表2。

表1 PD-L1(22C3)表达强度与EGFR基因突变的关系

表2 EGFR基因状态与PD-L1(22C3)表达的关系

图1 EGFR基因突变检测结果

图2 PD-L1染色强度TPS评分分级(IHC×200)

2.4EGFR基因突变类型与PD-L1(22C3)表达强度的关系:186例EGFR突变的病例中，21外显子L858R点突变95例，19外显子缺失突变73例，其余罕见位点突变及双基因突变18例，EGFR基因突变类型与PD-L1表达强度之间差异无统计学意义(P=0.251)。见表3。

表3 EGFR基因突变类型与PD-L1(22C3)表达强度的关系

3 讨 论

EGFR是最重要的肺癌驱动基因，其产物通过细胞外表皮生长因子的作用，使得下游靶点磷酸化，促进细胞增殖和存活，进而促使肿瘤发生。针对EGFR的靶向治疗应用于临床并延长了NSCLC患者的生存期[2]。PD-L1可与T细胞表面PD-1结合，从而抑制T细胞的增殖和细胞因子的产生。一些肿瘤细胞会出现PD-L1表达上调，抑制活性T细胞对肿瘤细胞的免疫监视。靶向抑制PD1与PD-L1免疫检查点，能够活化细胞毒性T细胞功能，对抗肿瘤细胞，是近年来肺癌治疗领域的新突破。但国外相关研究却显示ICIs对EGFR突变型NSCLC患者的治疗效果并不理想[3,4]。

Takada等[5]回顾性分析了441例手术切除的原发性肺腺癌PD-L1表达与EGFR基因突变的关系，结果发现EGFR突变的患者PD-L1表达率增高，但是EGFR突变位点与PD-L1表达之间没有显著关联。Azuma等[6]通过免疫组化染色分析并评估了164例手术切除的NSCLC样本，结果显示，EGFR突变与PD-L1表达有显著相关性。EGFR突变型NSCLC比EGFR野生型NSCLC表达更高的PD-L1,且EGFR突变是导致PD-L1表达上调的独立因素。Ota研究团队[7]通过RT-PCR及流式细胞分析技术对EGFR突变细胞系(HCC827、H1975、PC-9、11-18、H1650)及野生型细胞系(H322、A549、1-87、LK87、H23、H2122、H1437、H1573、H1944、H157、H596、H460、H1299)的PD-L1mRNA以及PD-L1蛋白表达进行检测。发现EGFR突变型细胞系PD-L1 mRNA以及蛋白表达均高于野生型。Song等[8]对385例肺腺癌PD-L1的表达情况进行研究，将肿瘤细胞TPS≥5%视为阳性cut off值，该研究发现205例EGFR突变患者中，112例(54.6%)PD-L1表达阳性；180例EGFR野生型患者中74例(41.1%)表达阳性(P=0.008)。同时发现在385例患者中有24例存在基因突变共表达的情况，且共突变比单基因突变对PD-L1阳性表达的影响更大(P<0.001)。

本文分析了308例同时行EGFR基因突变和PD-L1免疫组化检测的NSCLC病例，将PD-L1免疫表达根据TPS评分分为阴性(TPS<1%)、弱阳性(1%≤TPS<10%)、中等阳性(10%≤TPS<50%)、强阳性(TPS≥50%)四组，发现随着PD-L1表达的加强，EGFR突变率呈现一个逐步下降的趋势(71.30% vs 57.55% vs 50.00% vs 44.12%)，经统计学分析PD-L1表达强度与EGFR突变率之间有显著相关性(P=0.017)，并且二者之间呈现较弱的负相关性(r=-0.176，P=0.002)，也就是说PD-L1表达越强，EGFR的突变率越低。此外，将PD-L1阴性或弱阳性表达划分为低表达组，将PD-L1中等阳性或强阳性表达划分为高表达组，EGFR突变型中低表达组占74.19%、高表达组占25.81%，野生型中PD-L1低表达组和高表达组分别占62.30%和37.70%。经统计学分析EGFR基因突变状况与PD-L1表达水平高低之间差异有统计学意义，EGFR突变型NSCLC患者中PD-L1更倾向于低表达。我们的研究结果与Takada[5]、Azuma[6]、Song[8]等的研究结果略有不同，分析可能是由于我们的研究没有把PD-L1的表达结果简单的区分为阴性或阳性，而是分为阴性、弱阳性、中等阳性、强阳性四等级分组来观察PD-L1蛋白表达与EGFR基因突变率的相关性；又根据表达强度不同划分为低表达组和高表达组，来观察EGFR基因突变状态与PD-L1表达强度的关系。我们的研究结果更能详尽的分析EGFR基因状态与PD-L1表达强度之间的关系，对解释ICIs对EGFR突变型NSCLC治疗效果不理想的现象更具有说服力。EGFR突变型NSCLC患者的治疗应以EGFR-TKIs或EGFR-TKIs联合化疗为主。

308例研究对象中，有186例存在EGFR基因突变，其中95例为21外显子L858R基因突变，73例为19外显子缺失基因突变73例，18例为罕见位点突变或双基因突变。统计分析发现PD-L1表达强弱与EGFR基因突变类型之间差异无统计学意义(P=0.251)，PD-L1表达强弱与EGFR基因突变类型之间无相关性，与以往研究结果相同。

综上所述，通过我们的分析发现PD-L1表达强度与EGFR突变率之间呈现负相关性，PD-L1表达越强，EGFR的突变率越低；EGFR突变型NSCLC患者PD-L1更倾向于低表达，这也解释了EGFR突变NSCLC患者的ICIs免疫治疗效果不理想的原因。但是PD-L1表达强弱与EGFR基因突变类型之间无相关性。