刘 冰, 方存明, 马小林
(安徽省宣城市人民医院心血管内科, 安徽 宣城 242000)
缺血性心脏疾病是心内科常见的疾病,在世界范围内发病率和死亡率均很高,及时、有效的血液再灌注是主要治疗手段,但常常引发心肌缺血/再灌注损伤,给缺血心肌组织造成更严重的损伤,因此采取针对性措施控制缺血/再灌注过程中的心肌受损,是缺血性心脏疾病临床治疗中亟需解决的难点[1]。自噬是真核细胞内特有的依赖于溶酶体的胞内物质分解代谢过程,对于维持缺血/再灌注过程中细胞内环境稳态至关重要,促进自噬可减轻氧糖剥夺/再灌注引发的神经细胞损伤[2],自噬贯穿心肌缺血/再灌注损伤全过程,通过促进自噬流量可抑制心肌缺血/再灌注引发的心肌细胞凋亡和坏死性下垂,研究发现增强自噬,并降低炎症和氧化应激水平可明显减轻缺氧/复氧诱发的心肌细胞H9c2损伤,有效防治心肌梗死[3]。缺氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor 1α,HIF-1α)/bcl2/腺病毒E1B相互作用蛋白3(bcl2/Adenovirus E1B 19kDa Interacting Protein 3,BNIP3)可通过调控细胞和线粒体自噬介导各组织器官缺血/再灌注损伤过程,敲除HIF-1α基因可其下游因子降低bcl2/腺病毒E1B相互作用蛋白3(bcl2/Adenovirus E1B 19kDa Interacting Protein 3,BNIP3)表达,显著减弱线粒体自噬,促进活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)产生,加重缺氧/复氧诱导的肾小管细胞损伤凋亡[4],上调HIF-1α、BNIP3表达可增强自噬作用,减轻缺氧诱导的视网膜色素上皮细胞炎症损伤,增强其生存能力[5],还可通过促进自噬和抑制凋亡而减轻缺氧复氧导致的H9c2细胞损伤[6]。乔松素是提取自蜂胶的一种天然黄酮类化合物,具有广泛的抗炎、抗氧化活性,可通过抑制氧化应激改善高脂饲养诱导的非酒精性脂肪性肝病大鼠症状[7],并减轻缺血/再灌注引发的肠黏膜损伤[8],还可激活自噬,减轻缺血再灌注造成的心肌细胞凋亡损伤,对心肌组织发挥保护作用,但其是否是通过调节HIF-1α/BNIP3信号实现的,目前还不清楚,本文对大鼠心肌细胞H9c2进行缺氧/复氧处理,构建心肌缺血/再灌注体外损伤模型,探究乔松素通过调控HIF-1α/BNIP3介导的细胞自噬减轻缺氧/复氧诱导的心肌细胞损伤的机制。
1.1主要试剂及仪器:大鼠心肌细胞H9c2(武汉普诺赛生命科技有限公司)-货号:CL-0089;乔松素(纯度:HPLC≥98%)、MTT试剂盒/细胞增殖检测试剂盒、大鼠白细胞介素(interleukin,IL)-18(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)试剂盒、大鼠IL-17 ELISA试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)、-货号:IP0920、M1020、SEKR-0054、SEKR-0007;ROS检测试剂盒(北京盒子生工科技有限公司)-货号:AKCE002-1;Annexin V 凋亡检测试剂盒(FITC/PI双染法)、过氧化氢酶(Catalase,CAT)活性检测试剂盒、丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量检测试剂盒(上海生工生物工程股份有限公司)-货号:E606336、D799598、D799762;单丹磺酰戊二胺(monodansylcadaverine,MDC)(上海懋康生物科技有限公司)-货号:MX4453;BCA蛋白检测试剂盒、兔源抗大鼠P62一抗、兔源抗大鼠HIF-1α一抗、兔源抗大鼠LC3一抗、兔源抗大鼠BNIP3一抗(美国Abcam公司)-货号:ab102536、ab109012、ab179483、ab48394、ab109362;大鼠IL-1β ELISA试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)检测试剂盒、辣根过氧化物酶偶联山羊抗兔IgG二抗、兔源抗大鼠Anti-β-actin一抗(上海碧云天生物技术有限公司)-货号:PI303、S0057S、A0208、AF5003等。流式细胞仪(美国BD公司)-型号:Accuri C6;高级倒置荧光显微镜(上海普丹光学仪器有限公司)-型号:ICX41LED;迷你垂直电泳转印系统、电泳仪电源、酶标仪(美国Bio-Rad公司)-型号:1658033、PowerPac Basic 1645050、JC-1089A;全自动凝胶成像分析系统(北京赛智创业科技有限公司)-型号:ChampGel 6000等。
1.2方 法
1.2.1乔松素作用浓度筛选:大鼠心肌细胞H9c2快速解冻后复苏,以含有10%胎牛血清和1%双抗的DMEM培养基培养,传代后接种在无菌的96孔板中,以1×104个/孔的密度培养24h,然后在94%N2、5%CO2、1%O2的低氧环境中培养4h后移至21%O2、5%CO2的正常氧环境中继续培养6h,制备缺氧/复氧模型[9],接着马上分别以0、25、50、100、200、300μg/mL乔松素处理[10],以0μg/mL的乔松素做对照,未接种细胞的孔做空白对照,24h后采用MTT试剂盒测定各组细胞活力,具体参照制造商说明书中方法操作,计算公式为=(药物处理组吸光值-空白对照组吸光值)/(对照组吸光值-空白对照组吸光值)×100%。
1.2.2心肌细胞缺氧/复氧模型制备及分组处理:H9c2细胞传代后接种在无菌的24孔板中,以1×105个/孔的密度培养24h,随机分为对照组、模型组、乔松素低剂量组、乔松素高剂量组、HIF-1α siRNA阴性对照组、乔松素高剂量+HIF-1α siRNA组,除对照组外其余各组H9c2细胞建立缺氧/复氧模型后,马上进行分组处理:对照组和模型组不进行处理,乔松素低剂量组和乔松素高剂量组分别以100、200μg/mL乔松素进行处理,HIF-1α siRNA阴性对照组以脂质体2000转染HIF-1α siRNA,乔松素高剂量+HIF-1α siRNA组以200μg/mL乔松素进行处理的同时转染HIF-1α siRNA阴性对照,各组细胞均处理24h后收集其培养液和细胞沉淀备用。
1.2.3MTT法、流式细胞实验分别检测各组细胞增殖及凋亡:H9c2细胞传代后接种在无菌的96孔板中,以1×104个/孔的密度培养24h,以1.2.2中方法分组处理24h后,采用MTT法测定各组细胞活力,方法见1.2.1。以DMEM培养基重悬1.2.2中收集的各组细胞,混匀后测定细胞密度,每组取1×105个细胞经PBS洗涤后,采用Annexin V凋亡检测试剂盒进行FITC/PI双染,具体参照制造商说明书中方法操作,以PBS洗涤后置于流式细胞仪中测定各组细胞凋亡率。
1.2.4ELISA测量各组H9c2细胞炎性因子IL-17、IL-1β、IL-18及氧化应激因子CAT、GSH-Px、ROS、MDA水平:1.2.2中收集的各组细胞培养液,以2000r/min离心10min后取上清,采用ELISA试剂盒测量其中炎性因子IL-17、IL-1β、IL-18水平,具体参照各自制造商说明书中方法操作。1.2.2中收集的各组细胞,以RIPA裂解液分别裂解提取其中总蛋白,以BCA法测出其浓度,然后采用试剂盒测量细胞蛋白样品液中氧化应激因子CAT、GSH-Px、ROS、MDA水平,具体参照各自制造商说明书中方法操作。
1.2.5MDC荧光染色法检测各组H9c2细胞自噬体形成:H9c2细胞传代后接种在无菌的96孔板中,以1×105个/孔的密度培养24h,以1.2.2中方法分组处理24h后,加入含有50μmoL/L MDC的DMEM培养基,避光培养30min,弃去培养基,洗涤后以50%磷酸甘油固定细胞,在高级倒置荧光显微镜中观察各组细胞自噬体形成并拍照,计算各组自噬体相对含量=药物处理组自噬体数目/对照组自噬体数目×100%。
1.2.6免疫印迹法检测各组H9c2细胞自噬及HIF-1α/BNIP3通路相关蛋白表达:1.2.2中收集的各组细胞,以RIPA裂解液分别裂解提取其中总蛋白,以BCA法测出其浓度后,每组取20g进行变性、上样跑电泳使蛋白按分子量大小分散在凝胶中,通过湿转将胶中蛋白转至硝酸纤维素膜,按照LC3、P62、HIF-1α、BNIP3、β-actin这5种蛋白分子量将其自膜上剪下,分别孵育5%脱脂奶粉、相应一抗、山羊抗兔二抗后对二抗偶联的辣根过氧化物酶显色,拍照后以软件ImageJ分析,对各组蛋白灰度值定量后统计得出其相对表达。
2.1乔松素对缺氧复氧诱导的H9c2细胞活力的影响:不同浓度乔松素可增强缺氧复氧诱导的H9c2细胞活力,并随剂量升高而作用增强,在浓度为200mg/L时进入平台期,因而选择100、200μg/mL乔松素进行后续实验。见图1。
2.2乔松素对缺氧复氧诱导的H9c2细胞增殖与凋亡的影响:与对照组相比,模型组细胞活力降低(P<0.05),凋亡率升高(P<0.05)。与模型组相比,乔松素低、高剂量组细胞活力均升高(P<0.05),凋亡率均降低(P<0.05);乔松素高剂量组细胞活力相比乔松素低剂量组进一步升高(P<0.05),凋亡率进一步降低(P<0.05);HIF-1α siRNA阴性对照组细胞活力、凋亡率无显著差异(P>0.05)。与乔松素高剂量组相比,乔松素高剂量+HIF-1α siRNA组细胞活力降低(P<0.05),凋亡率升高(P<0.05)。见图2、表1。
图1 不同浓度乔松素对缺氧复氧诱导的H9c2细胞活力的影响
图2 流式细胞实验检测各组H9c2细胞凋亡
2.3乔松素对缺氧复氧诱导的H9c2细胞炎性因子产生的影响:与对照组相比,模型组细胞培养基上清中IL-17、IL-1β、IL-18水平升高(P<0.05)。与模型组相比,乔松素低、高剂量组细胞培养基上清中IL-17、IL-1β、IL-18水平均降低(P<0.05);乔松素高剂量组细胞培养基上清中IL-17、IL-1β、IL-18水平相比乔松素低剂量组进一步降低(P<0.05);HIF-1α siRNA阴性对照组细胞培养基上清中IL-17、IL-1β、IL-18水平无显著差异(P>0.05)。与乔松素高剂量组相比,乔松素高剂量+HIF-1α siRNA组细胞培养基上清中IL-17、IL-1β、IL-18水平升高(P<0.05)。见表2。
表1 各组H9c2细胞活力与凋亡率
表2 各组H9c2细胞培养基上清中IL-17 IL-1β IL-18水平
2.4乔松素对缺氧复氧诱导的H9c2细胞氧化应激因子产生的影响:与对照组相比,模型组细胞CAT、GSH-Px水平降低(P<0.05),ROS、MDA水平升高(P<0.05)。与模型组相比,乔松素低、高剂量组细胞CAT、GSH-Px水平均升高(P<0.05),ROS、MDA水平均降低(P<0.05);乔松素高剂量组细胞CAT、GSH-Px水平相比乔松素低剂量组进一步升高(P<0.05),ROS、MDA水平进一步降低(P<0.05);HIF-1α siRNA阴性对照组细胞CAT、GSH-Px、ROS、MDA水平无显著差异(P>0.05)。与乔松素高剂量组相比,乔松素高剂量+HIF-1α siRNA组细胞CAT、GSH-Px水平降低(P<0.05),ROS、MDA水平升高(P<0.05)。见表3。
表3 各组H9c2细胞CAT GSH-Px ROS MDA水平
表4 各组H9c2细胞自噬体相对含量
2.5乔松素对缺氧复氧诱导的H9c2细胞自噬体形成的影响:与对照组相比,模型组细胞自噬体相对含量降低(P<0.05)。与模型组相比,乔松素低、高剂量组细胞自噬体相对含量均升高(P<0.05);乔松素高剂量组细胞自噬体相对含量相比乔松素低剂量组进一步升高(P<0.05);HIF-1α siRNA阴性对照组细胞自噬体相对含量无显著差异(P>0.05)。与乔松素高剂量组相比,乔松素高剂量+HIF-1α siRNA组细胞自噬体相对含量降低(P<0.05)。见图3、表4。
2.6乔松素对缺氧复氧诱导的H9c2细胞自噬及HIF-1α/BNIP3通路相关蛋白表达的影响:与对照组相比,模型组细胞LC3-II/LC3-I及P62、HIF-1α、BNIP3蛋白表达降低(P<0.05)。与模型组相比,乔松素低、高剂量组细胞LC3-II/LC3-I及P62、HIF-1α、BNIP3蛋白表达均升高(P<0.05);乔松素高剂量组细胞LC3-II/LC3-I及P62、HIF-1α、BNIP3蛋白表达相比乔松素低剂量组进一步升高(P<0.05);HIF-1α siRNA阴性对照组细胞LC3-II/LC3-I及P62、HIF-1α、BNIP3蛋白表达无显著差异(P>0.05)。与乔松素高剂量组相比,乔松素高剂量+HIF-1α siRNA组细胞LC3-II/LC3-I及P62、HIF-1α、BNIP3蛋白表达降低(P<0.05)。见图4、表5。
表5 各组H9c2细胞自噬及HIF-1α/BNIP3通路相关蛋白相对表达
图3 MDC荧光染色法检测各组H9c2细胞自噬体的形成(×400)
图4 免疫印迹法检测各组H9c2细胞自噬及HIF-1α/BNIP3通路相关蛋白表达(×400)
缺血性心脏病作为临床常见心血管疾病,经皮冠状动脉介入治疗及冠状动脉旁路移植等是现代医学采用的主要治疗策略,但由于缺血/再灌注损伤的存在,患者治疗后心衰发生率仍然较高,因此减轻心肌缺血/再灌注损伤是改善心肌缺血患者预后的关键[11,12]。心肌细胞缺氧/复氧模型是研究体外心肌缺血/再灌注损伤的常用模型,本文对H9C2细胞进行缺氧4h/复氧6h处理造模,结果显示,H9C2细胞经缺氧/复氧处理后,其细胞活力、细胞CAT及GSH-Px水平降低,凋亡率、细胞培养基上清中IL-17、IL-1β及IL-18水平、细胞ROS及MDA水平升高,表明缺氧/复氧可诱发ROS和炎性因子大量产生,导致高水平的炎症与氧化应激,导致心肌细胞活力降低,诱导其凋亡,揭示心肌细胞缺氧/复氧模型构建成功。
心肌缺血/再灌注损伤发生的重要病理基础是炎症、氧化应激、心肌细胞凋亡和自噬受限等,研究证实,促进自噬及抑制炎症因子表达可显著改善缺氧/复氧损伤的H9C2细胞活力,保护心肌组织免于缺血再灌注损伤[13,14]。乔松素作为一种具有明显抗氧化与抗炎作用的天然化合物,对缺血/再灌注引发的组织细胞损伤发挥有效的保护作用,其机制与激活自噬、减轻氧化应激与炎症、抑制凋亡有关,不仅可改善肝缺血再灌注损伤导致的肝脏损伤,还可抑制缺血再灌注造成的心肌细胞凋亡,减弱心肌缺血再灌注后的血管收缩功能,本文以不同剂量乔松素处理缺氧/复氧H9c2细胞,均可升高细胞活力、自噬体相对含量、细胞CAT及GSH-Px水平、细胞LC3-II/LC3-I及P62蛋白表达,并降低细胞凋亡率、细胞培养基上清中IL-17、IL-1β及IL-18水平、细胞ROS及MDA水平,且高剂量乔松素作用更强,表明乔松素可降低ROS和炎性因子产生水平,抑制炎症与氧化应激,促进自噬,减轻缺氧/复氧导致的心肌细胞凋亡,促使其存活,揭示乔松素可保护心肌细胞免于缺氧/复氧诱发的损伤,剂量越高,作用越强。
HIF-1α/BNIP3是重要的自噬调控信号,与缺血/再灌注造成的一系列组织细胞损伤过程关系密切,上调HIF-1α/BNIP3通路表达可通过抑制肾缺血再灌注引发的肾小管上皮细胞凋亡减轻大鼠肾损伤[15],还可增强细胞及其线粒体自噬,减轻缺氧复氧所致的H9c2细胞凋亡损伤,提高细胞活力,起到显著的心肌保护作用,本文结果显示,缺氧/复氧处理可下调H9c2细胞HIF-1α、BNIP3蛋白表达,而缺氧/复氧H9c2细胞以不同剂量乔松素处理后HIF-1α、BNIP3蛋白表达均升高,表明HIF-1α/BNIP3信号参与介导缺氧/复氧引发的H9c2细胞损伤及乔松素对此损伤的减轻过程,另外以乔松素和HIF-1α siRNA联合处理缺氧/复氧H9c2细胞,相比乔松素单独处理,可降低细胞活力、自噬体相对含量、细胞CAT及GSH-Px水平、细胞LC3-II/LC3-I及P62、HIF-1α、BNIP3蛋白表达,升高细胞凋亡率、细胞培养基上清中IL-17、IL-1β及IL-18水平、细胞ROS及MDA水平,表明以HIF-1α siRNA下调HIF-1α/BNIP3通路蛋白表达,可减弱乔松素的抗炎与抗氧化应激作用,拮抗其对自噬的增强作用,最终逆转乔松素对缺氧/复氧引发的H9c2细胞损伤凋亡的抑制作用,揭示乔松素激活自噬,减轻缺氧/复氧诱导的心肌细胞损伤是通过上调HIF-1α表达实现的。
综上所述,乔松素可增强HIF-1α/BNIP3通路蛋白表达,促进自噬,降低炎症因子产生水平,抑制炎症与氧化应激发生发展,抑制缺氧/复氧诱导的心肌细胞凋亡,提高其细胞存活能力,最终明显减轻细胞损伤,上调HIF-1α/BNIP3通路可能是其药理机制,本文有助于深入全面的阐释心肌缺血/再灌注损伤发生机制,并为临床防治心肌缺血/再灌注损伤的发生发展提供了新的候选药物,对缺血性心脏病的治疗做出了一定贡献。