含花青素双层指示薄膜的贮藏稳定性

王文艳 周 希 魏 贞 喻惜珍 熊国远

(1. 河南农业职业学院食品工程学院，河南 郑州 451450；2. 安徽农业大学茶与食品科技学院，安徽 合肥 230036； 3. 安徽省农产品加工工程实验室，安徽 合肥 230036)

近年来，天然色素指示薄膜常用来检测食品的新鲜度，其作用机制是食品在由新鲜到腐败的过程中，微生物和蛋白氧化会释放出胺类物质，造成食品包装内的环境呈碱性，具有pH响应性的天然色素会产生可见的颜色变化，以此判断食品新鲜程度[1-2]。该方法具有低成本、实时、可生物降解和方便安全等优点[3]。目前，具有pH响应性的天然色素主要来源于植物提取物，例如花青素[4]、红萝卜提取物[5]、姜黄素[6]和马黛茶提取物[7]等。但从植物中分离获取的花青素极不稳定，容易受温度、pH、光、氧气、酶和金属离子的影响，从而发生降解。因此，如何提高天然色素在薄膜基质中的稳定性是亟待解决的问题。Bąkowska等[8]发现，紫外线对花青素稳定性的影响要大于高温和贮藏时间。Zhai等[9]采用含有TiO2的吉兰糖胶基的光阻隔层(外层)来保护由琼脂和花青素制成的指示层(内层)。He等[10]将玉米醇溶蛋白薄膜和指示薄膜复合，制备出高疏水性和高机械性能的双层指示膜。Zhou等[11]以卡拉胶基质作为内层，花青素、姜黄素和花青素—姜黄素(1∶1)为指示剂，魔芋葡甘聚糖和山茶油作为疏水保护外层，制备指示薄膜并测定各薄膜的理化性能，结果表明疏水保护层的嵌入显著改善了指示薄膜的疏水性和抗紫外性能。上述研究均缺乏对指示薄膜贮藏稳定性的研究。

研究拟以卡拉胶为基质，花青素为指示层，魔芋葡甘聚糖和山茶油混合而成的乳化层作为疏水外层，通过浇铸的方法制备双层指示薄膜，测定指示薄膜在室温、冷藏和冷冻条件下贮藏35 d的抗氧化性能、厚度、机械性能和水分等指标，评价该指示薄膜的贮存稳定性，以期为花青素指示薄膜的商业化应用提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料与试剂

越橘花青素：纯度35%，西安百川生物科技公司；

姜黄素：纯度95%，北京索莱宝科技公司；

魔芋葡甘聚糖、κ-卡拉胶：合肥博美生物科技有限公司；

山茶油：江西宝林天然香料有限公司；

甘油：西陇科学股份有限公司；

吐温80、聚苯乙烯培养皿和无水硅胶：上海源叶生物科技有限公司；

其余试剂：分析纯，国药集团试剂有限公司。

1.2 试验设备

分析电子天平：JA503型，常州幸运电子设备有限公司；

超声波细胞破碎仪：JY92-IIN型，宁波新芝生物科技股份有限公司；

高速分散器：IKA型，德国IKA科技有限公司；

智能薄膜拉伸力学试验仪：XLW型，济南兰光光电技术有限公司；

全自动手持色差计：CR-400型，上海沪粤明科学仪器有限公司；

紫外分光光度计：PE-Lambda型，美国PE仪器有限公司。

1.3 花青素指示膜的制备与处理

参照文献[11]的方法制备出花青素指示膜，将双层指示膜放置在25 ℃环境中干燥72 h后待测。将干燥后的花青素指示膜分别置于25，4，-18 ℃下贮藏，每隔1周(0，7，14，21，28，35 d)取样在室温下平衡6 h后测定厚度、机械强度、色差和抗氧化性能等指标。

1.4 理化指标测量

1.4.1 机械性能 参考Ruan等[12]的方法并稍作修改。将花青素指示膜裁剪为8 cm×2 cm的矩形，使用薄膜拉伸仪测量断裂伸长率(EAB)，初始夹具之间的距离设置为60 mm，以50 mm/min的拉伸速度进行试验测量抗拉强度(TS)。

1.4.2 厚度 利用精度为0.001 mm的螺旋测微器进行测定，在每片薄膜上随机选取5个点进行测量。

1.4.4 抗氧化性能

(1) 总酚含量测定：称取25 mg薄膜加入到3 mL乙醇溶液中混合均匀后得到提取液。总酚含量的测定参考Balqis等[13]的方法进行。量取0.3 mL提取液，加入2.5 mL 福林酚试剂(体积分数10%)，再加入2 mL 7.5 g/mL碳酸钠溶液，50 ℃水浴5 min后于600 nm处测量吸光度值。用没食子酸溶液(0～1 000 mg/L)绘制标准曲线。结果以每克薄膜的微克没食子酸当量(GAE)表示。

(2) DPPH自由基清除率测定：参照Adilah等[14]的方法。量取3 mL提取液并加入1 mL 0.1 mmol/L的DPPH溶液后混合均匀并在黑暗处室温静置30 min。测量混合液和以未加提取液的DPPH溶液在517 nm处的吸光度值。DPPH自由基清除率按式(1)计算：

(1)

式中：

S——DPPH自由基清除率，%；

A1——加入提取液的DPPH溶液的吸光度值；

A2——未加提取液的DPPH溶液的吸光度值。

(3) ABTS自由基清除率测定：参照文献[14]并略作修改。将7 mmol/L ABTS溶液与2.45 mmol/L过硫酸钾溶液以体积比1∶1混合并静置16 h。将所得混合液用乙醇稀释直至其在734 nm处的吸光度值在0.70±0.02。同时，将40 mL薄膜乙醇提取液加入到3 960 mL稀释液中后静置6 min，测定其在734 nm处的吸光度值。用没食子酸溶液(0～1 000 mg/L)绘制标准曲线。结果以每克薄膜的微克没食子酸当量(GAE)表示。

1.5 统计分析

用SPSS 24.0软件对数据进行统计分析，用单因素方差分析(ANOVA)进行差异显著性分析，多重比较采用LSD法，使用Origin 2021进行作图，P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极其显著。结果用平均值±标准偏差表示。

2 结果与分析

2.1 机械性能

由图1可知，在25，4，-18 ℃贮藏35 d后薄膜的断裂伸长率分别为(19.13±5.94)%，(19.56±3.64)%，(18.47±3.73)%，相较于0 d的分别下降55.28%，55.29%，57.81%(P<0.05)，且随着贮藏时间的延长，所有薄膜在贮藏期间的断裂伸长率总体呈先下降后上升再下降的趋势。贮藏第14天，25 ℃组的EAB显著低于-18 ℃组(P<0.05)，出现这种现象的原因可能是低温下薄膜中山茶油的均匀度保持较好，山茶油起到的增塑作用并未减弱，与文献[11]研究结果一致，适量山茶油的添加显著改善了薄膜的EAB。由图2可知，薄膜在25 ℃下贮藏7 d时的TS值显著大于0 d的(P<0.05)，与EAB的变化趋势相反，可能是以魔芋葡甘聚糖和卡拉胶为主要基质的薄膜在贮藏过程中发生了氧化，导致薄膜老化，且在老化过程中，水分和增塑剂迁移到周围环境，最终导致薄膜的TS值增大。此外，薄膜贮藏第7～35天TS无显著变化(P>0.05)，但整体呈现下降的趋势，可能是由于山茶油的增塑作用导致EAB增大，EAB的增大往往导致TS降低。薄膜的EAB在贮藏35 d后相较于0 d的显著下降(P<0.05)，结合水、自由水的损失、甘油的渗出以及在不同环境温度下薄膜的老化速度造成了EAB的下降。

小写字母不同表示相同温度下不同贮藏时间的样品之间差异显著(P<0.05)；大写字母不同表示相同贮藏时间下不同贮藏温度的样品之间差异显著(P<0.05)

小写字母不同表示相同温度下不同贮藏时间的样品之间差异显著(P<0.05)

2.2 厚度稳定性

由图3可知，在贮藏第7～35天指示薄膜的厚度保持稳定，薄膜的厚度范围为0.126～0.162。薄膜在第7天的厚度相较于0 d的显著增大(P<0.05)，其原因可能是山茶油作为疏水性材料添加到亲水性KGM基质中后在不同的温度下贮藏时形成了不致密且较疏松的结构，导致指示膜厚度的增加，与Liu等[15]研究结果一致。

小写字母不同表示相同温度下不同贮藏时间的样品之间差异显著(P<0.05)

2.3 颜色稳定性

由表1可知，指示薄膜在不同温度下贮藏L*值呈先升高后下降的趋势，且贮藏35 d后，指示薄膜在25，4，-18 ℃ 的L*值相较于贮藏0 d的分别下降2.4%，13.13%，26.80%，下降的原因可能与成膜基质化学构成有关，随着贮藏时间的延长，魔芋葡甘聚糖和卡拉胶分子结构可能发生变化和重排[16]，重排过程中基质结构变得更加紧凑，从而降低了薄膜的透明度，导致指示薄膜L*降低。-18 ℃下薄膜L*值下降的速率要高于25 ℃和4 ℃下的，可能是由于低温下整体老化程度较低，且低温下自由水可形成冰晶，导致指示薄膜的不透明度升高，造成L*下降。

由表2可知，25 ℃贮藏下的薄膜a*值总体比较稳定，只有贮藏第35天出现显著变化(P<0.05)，原因在于薄膜在贮藏过程中，水和甘油从薄膜基质中发生迁移。指示薄膜在不同温度下a*值的变化可能受花青素结构的转变和山茶油状态的影响。

由表3可知，随着贮藏时间的延长，25，4，-18 ℃贮藏指示薄膜的b*值均显著增大(P<0.05)。色差的测定结果表明，指示薄膜在-18 ℃贮藏时a*和b*的变化小于25 ℃和4 ℃下的，因此薄膜在-18 ℃贮藏时具有良好的颜色稳定性。

2.4 抗氧化性能的变化

2.4.1 总酚含量的变化 由图4可知，贮藏7 d后薄膜的总酚含量显著下降(P<0.05)。当贮藏温度不变时，随着贮藏时间的延长，薄膜的总酚含量呈显著下降趋势(P<0.05)，且-18 ℃贮藏的薄膜总酚含量下降速率最大，可能是由于薄膜中的花青素和山茶油中的酚类物质与薄膜基质(KGM-CAR)结构通过氢键相连，导致其在抗氧化分析中不能与自由基相互作用，从而降低了花青素在低温下的抗氧化活性。薄膜在25 ℃贮藏第14天和第21天时总酚含量下降速率显著快于4 ℃和8 ℃下的(P<0.05)，这是由于花青素的热敏性，温度越高，花青素结构被破坏越严重，从而导致其总酚含量的快速降低。

表1 指示薄膜在不同温度和时间下L*值的变化†

表2 指示薄膜在不同温度和时间a*值的变化†

表3 指示薄膜在不同温度和时间下b*值的变化†

小写字母不同表示相同温度下不同贮藏时间的样品之间差异显著(P<0.05)；大写字母不同表示相同贮藏时间下不同贮藏温度的样品之间差异显著(P<0.05)

2.4.2 DPPH自由基清除能力 由图5可知，随着贮藏时间的延长，温度对指示薄膜的DPPH自由基清除能力的影响不显著(P>0.05)，含有花青素的指示薄膜在不同温度下贮藏中前期(0～28 d)保持了比较好的抗氧化活性。此外，-18 ℃贮藏35 d后指示薄膜的DPPH自由基清除能力最低，与Adilah等[14]发现的在大豆分离蛋白中添加芒果核提取物贮藏90 d后的结果一致。指示薄膜在贮藏7 d后对DPPH自由基清除能力逐渐升高，可能是由于山茶油中酚类物质的释放量增加引起的。这也从侧面说明薄膜的抗氧化活性主要是由酚类物质提供的。

小写字母不同表示相同温度下不同贮藏时间的样品之间差异显著(P<0.05)；大写字母不同表示相同贮藏时间下不同贮藏温度的样品之间差异显著(P<0.05)

2.4.3 ABTS自由基清除能力 由图6可知，随着贮藏时间的延长，薄膜在不同温度下贮藏的ABTS自由基清除能力总体呈下降的趋势。25 ℃条件下，贮藏第14天薄膜的ABTS自由基清除能力达到最高值，为9.44 μg/g，比4 ℃和-18 ℃下的最高值高出24.90%和21.08%。在成膜过程中，高温使魔芋葡甘聚糖和卡拉胶结构发生变化，成膜基质和其他化合物之间通过氢键键合，使成膜基质不能完全恢复到原来的结构，从而改善了成膜基质与花青素、水和甘油之间的相互作用，但在25 ℃贮藏时，薄膜基质的结构发生改变，促使与薄膜结合的花青素和山茶油中的酚类物质的释放，从而使得薄膜在25 ℃贮藏14 d有最高的ABTS自由基清除能力。此外，不同温度贮藏35 d后ABTS自由基清除能力相较于贮藏14 d的显著下降与结合水、增塑剂和山茶油的损失有关。

小写字母不同表示相同温度下不同贮藏时间的样品之间差异显著(P<0.05)；大写字母不同表示相同贮藏时间下不同贮藏温度的样品之间差异显著(P<0.05)

由于薄膜结构中山茶油、水和甘油的损失，贮藏时间越长薄膜的老化程度越高，薄膜结构的变化或重排影响了薄膜的抗氧化性能。从抗氧化能力的结果来看，随着贮藏时间的延长，薄膜的总酚含量和ABTS自由基清除能力下降，但DPPH自由基清除能力升高。这可能是由于薄膜中所含的花青素和山茶油中会与水和甘油一样从薄膜基质中迁移到外界环境中。此外，抗氧化性能的降低不仅是由于花青素的损失，很大程度上也归结于薄膜基质结构的变化。

3 结论

薄膜的贮藏稳定性随着贮藏时间和温度的变化而变化。薄膜在贮藏过程中机械性能、颜色和抗氧化性性能的变化与结合水和甘油导致薄膜基质结构重排以及花青素和山茶油的损失有关。但研究仅从宏观层面分析了指示薄膜性能的变化，并未从机理上探讨变化发生的原因，未来可利用扫描电子显微镜和傅里叶变换红外光谱等技术手段从微观层面探讨各种变化发生的原因和机理。