黑蒜总酚的提取及抗氧化性研究

◎ 侯笑林，刘家岐，高 涵，杨延存

（青岛工学院，山东 青岛 266300）

黑蒜又名黑大蒜、发酵黑蒜、黑蒜头，是将新鲜的生蒜带皮放在高温高湿的发酵箱里发酵60～90天，让其自然发酵制成的食品[1]。黑蒜在保留生大蒜原有成分和功能的基础上，使生大蒜的抗氧化、抗酸化功效提高了数十倍，又把生大蒜本身的蛋白质大量转化成为人体所必需的8种氨基酸，进而被人体迅速吸收，对增强人体免疫力、恢复人体疲劳，保持人体健康起到巨大积极作用[2]。本文以黑蒜为原料，采用乙醇浸提法提取黑蒜中总酚，通过单因素试验和正交试验对其总酚的提取工艺条件进行优化，研究最佳提取工艺条件及显著影响因素，以期提高黑蒜总酚的提取量，同时以体外抗氧化体系为模型，研究其抗氧化活性，为进一步开展黑蒜活性物质研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

黑蒜，网上采购，新鲜、无公害、无糜烂。

1.2 仪器与设备

DHG-9240A型BS电热恒温鼓风干燥箱（上海康路仪器设备有限公司）、40目筛、80-2电动离心机（上海梅香仪器有限公司）、数显恒温水浴锅HH-6（上海梅香仪器有限公司）、数显恒温水浴锅HH-4（常州市华普达教学仪器有限公司）、JM-B5102分析天平（余姚市纪铭称重校验设备有限公司）、多功能粉碎机（铂欧五金厂）。

1.3 试验方法

1.3.1 黑蒜总酚提取流程[3-4]

黑蒜→去皮→清洗→烘干→粉碎、过筛→称取黑蒜粉末样品→按一定料液比加乙醇溶液→恒温提取→离心分离→上清液冷藏。

1.3.2 黑蒜总酚提取率的测定及计算方法[5]

以焦性没食子酸为标准品，准确称取20 mg，用水溶液溶解，定容到100 mL容量瓶中，得0.2 mg/mL标准没食子酸溶液。分别准确移取0、0.2、0.4、0.6、0.8 mL和1.0 mL于6支25 mL纳氏比色管中，加入Folin-ciocalteu试剂1.0 mL，摇匀后加入15%碳酸钠溶液2 mL，定容至10 mL，摇匀，放置2 h，于波长760 nm处测定吸光度，以焦性没食子酸含量（mg/mL）为横坐标，以对应的吸光度值为纵坐标，制作标准曲线。

吸取一定体积粗多酚溶液于比色管中，按上述步骤测定其测定吸光度，并在标准曲线上得出相应的浓度，计算总酚提取量。

W=C×V/m

式中：W为总酚提取量，单位为mg/g；C为Folinciocalteu法测定的提取液质量浓度，单位为g；V为提取液体积，单位为mL；m为黑蒜粉末质量，单位为g。

1.3.3 单因素试验

（1）乙醇体积分数对黑蒜总酚提取量的影响。准确称取1.00 g黑蒜干粉放入锥形瓶中，按照料液比1∶25分别加入体积分数10%、30%、50%、70%和90%的乙醇溶液，在50 ℃提取温度条件下提取40 min，离心分离，以总酚提取量为评价指标，确定最佳乙醇体积分数。

（2）料液比对黑蒜总酚提取量的影响。准确称取1.00 g黑蒜干粉放入锥形瓶中，分别按料液比为1∶10、1∶15、1∶20、1∶25和1∶30加入体积分数50%乙醇溶液，在50 ℃提取温度条件下提取40 min，离心分离，以总酚提取量为评价指标，确定最佳料液比。

（3）提取温度对黑蒜总酚提取量的影响。准确称取1.00 g黑蒜干粉放入锥形瓶中，按料液比为1∶25加入体积分数50%乙醇溶液，分别在提取温度为30、40、50、60 ℃和70 ℃条件下提取40 min，离心分离，以总酚提取量为评价指标，确定最佳提取温度。

（4）提取时间对黑蒜总酚提取量的影响。准确称取1.00 g黑蒜干粉放入锥形瓶中，按料液比为1∶25加入体积分数50%乙醇溶液，在50 ℃提取温度条件下分别提取20、40、60、80 min和100 min，离心分离，以总酚提取量为评价指标，确定最佳提取时间。

1.3.4 正交试验

根据单因素试验结果，选取乙醇体积分数、料液比、提取温度、提取时间四因素进行正交试验，每个因素设计三个水平，以总酚提取量为评价指标，设计L9（34）正交试验，优化黑蒜总酚提取工艺条件。

1.3.5 黑蒜总酚抗氧化活性的测定

（1）DPPH清除作用的测定[6-7]。取不同质量浓度样品溶液4 mL于试管中，依次加入2 mL 0.2 mmol/L DPPH溶液，25 ℃水浴中反应20 min，在517 nm处测定吸光度。以蒸馏水做空白。以相同浓度维生素C作对比。

式中，A1为4 mL样液+2 mL DPPH对应吸光度值；A2为4 mL样液+2 mL 95%的乙醇对应吸光度值；A3为4 mL蒸馏水+2 mL DPPH对应吸光度值。

（2）超氧自由基（O2-）清除作用的测定[8-9]。采用邻苯三酚自氧化法测定，取0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液4.0 mL，于25 ℃水浴中保温20 min，分别加入不同质量浓度1 mL样液和1 mL 25 mmol/L邻苯三酚溶液，混匀于25 ℃水浴中反应5 min，加入8%的HCl 1 mL终止反应，325 nm处测定吸光度（A）。用蒸馏水做空白。以相同浓度维生素C作对比。

式中，Ai为4 mL Tris-HCl+1 mL样液+2 mL邻苯三酚对应吸光度值；Aj为4 mL Tris-HCl+1 mL样液+2 mL蒸馏水对应吸光度值；Ac为4 mL Tris-HCl+1 mL蒸馏水+2 mL邻苯三酚对应吸光度值。

2 结果与分析

2.1 乙醇体积分数对黑蒜总酚提取量的影响

从图1可知，乙醇体积分数在10%～50%时，黑蒜中总酚的提取量逐渐升高，且在50%时达到最高，原因可能是多酚类物质在乙醇水溶液中的溶解度逐渐增大。当乙醇体积分数达到50%以上时，总酚提取量呈现出下降趋势，这可能是由于提取液中除多酚外的其他杂质逐渐增多，同时提取溶剂中水分减少，造成测定体系中多酚含量降低，测定数据下降。因此确定最佳的乙醇体积分数为50%。

图1 乙醇体积分数对黑蒜总酚提取量的影响图

2.2 料液比对黑蒜总酚提取量的影响

料液比是影响原料中总酚提取的因素之一。适当的料液比即可使原料中的多酚物质得到充分提取，还可减少溶剂的消耗及其回收成本。由图2可以看出，随着料液比的增加，总酚的提取量逐渐增加，在料液比为1∶10～1∶20时总酚提取量增加的幅度较为明显；但是当料液比大于1∶20时，总酚提取量增加的幅度不大，表明当料液比增大到1∶20时原料中的多酚类物质已被充分提取出来，总酚提取量达到峰值，因而继续增大料液比，总酚提取量不会明显提高，而且在实际生产中还造成溶剂浪费。因此，确定最佳的料液比为1∶20。

图2 料液比对黑蒜总酚提取量的影响图

2.3 提取温度对黑蒜总酚提取量的影响

由图3可知，30～50 ℃时，总酚提取量随温度的升高而增大，在50 ℃是总酚提取量最高。这是由于随着温度升高，分子运动速度加快，随温度上升产生的大量热能破坏了黑蒜内各物质之间的氢健和疏水健，大量多酚类物质的渗透、溶解、扩散速度加快，从而促进了原料中多酚类物质的溶出，是总酚提取量得以提高。60～70 ℃时，总酚提取量反而呈现下降趋势，这是由于多酚类物质的稳定性较差或者长时间受热影响了多酚氧化酶的催化能力，自身发生氧化或水解反应所致。因此，黑蒜中总酚提取的温度不宜过高，以50 ℃为宜。

图3 提取温度对黑蒜总酚提取量的影响图

2.4 提取时间对黑蒜总酚提取量的影响

从图4可以看出，黑蒜中总酚的提取量随提取时间的延长呈现出先增加后下降的趋势，在60 min时达到峰值，60 min后随着时间的延续，总酚提取量出现下降。这可能是因为随着时间的增加，黑蒜中多酚物质的溶解程度逐渐增强，而在60 min时达到峰值后，多酚的溶出已经接近于饱和，再继续增加提取时间的时候，析出的多酚由于受光、热、多酚氧化酶等各种外界因素的影响，极易被氧化。因此，60 min后反而随着时间的增加多酚提取量出现下降的情况。因此，确定最佳提取时间为60 min。

图4 提取时间对黑蒜总酚提取量的影响图

2.5 正交试验优化

由表1可知，试验中4个因素的影响力大小顺序为A＞D＞B＞C，对应影响黑蒜总酚提取效果因素的强弱顺序为乙醇体积分数＞提取时间＞料液比＞提取温度，且黑蒜总酚提取的最佳提取工艺为A2B2C3D2。由于计算出的最优组合不包含在正交表中，因而按最优组合配方进行验证试验，得出黑蒜总酚提取量为1.82 mg/g，因此确定A2B2C3D2为提取黑蒜总酚的最佳工艺条件，即乙醇体积分数50%、料液比1∶20、提取温度60 ℃、提取时间60 min。

表1 正交试验结果表

2.6 黑蒜总酚对DPPH清除率的影响

对DPPH清除率的实验结果如图5所示。由图可见，黑蒜总酚具有较强的清除DPPH的能力，随着黑蒜总酚溶液浓度的增大，清除能力显著提高。在浓度为0.5 mg/mL时，黑蒜总酚对DPPH清除率为56.8%，而在相同浓度下，维生素C对DPPH的清除率仅为40.1%，表明黑蒜总酚对DPPH清除率比维生素C高。

图5 黑蒜总酚与维生素C对DPPH清除率的影响图

2.7 黑蒜总酚对O2-清除率的影响

图6 黑蒜总酚和维生素C对清除率的影响图

3 结论

（1）乙醇浸提法提取黑蒜总酚的最佳工艺条件为乙醇体积分数50%、料液比1∶20、提取温度60 ℃、提取时间60 min，在此条件下，黑蒜总酚的提取量可达1.82 mg/g。

（2）黑蒜总酚对DPPH和O2-均表现出较强的清除能力，在一定浓度范围内，清除率随浓度增大而升高，且高于同浓度维生素C的清除率，说明黑蒜总酚的抗氧化性能较强。通过对所得总酚品质特性的研究，为黑蒜资源的综合利用和黑蒜中多酚类物质开发应用提供理论依据。