凌云白毫总酚提取工艺优化及抗氧化活性

冼丽清，李珊，冯彬，梁俭，刘晓凤

1. 桂西区域生态环境分析和污染控制重点实验室，百色学院化学与环境工程学院（百色 533000）；2. 百色学院材料科学与工程学院（百色 533000）

凌云白毫主产于凌云、乐业两县，是广西著名的土特产，因茶叶背面布满白色绒毛而得名。与我国东部常见茶种不同，凌云白毫是一种乔木类大叶茶种，所制茶叶以毛多、色翠、香高、味浓、耐泡等特色闻名于世。现代生理学研究证实，长期适度饮茶，对维护机体健康具有积极作用[1]，原因在于茶叶中含有大量具有重要生理功能的物质，如总酚[2]、总黄酮[3]和生物碱[4]等。其中，总酚是茶叶主要的功能性物质，其含量直接影响茶叶的等级与品质[5]。因地方经济欠发达，凌云白毫品牌意识薄弱，国内的受众范围极其狭窄，关于其生物活性物质的提取及性质研究基本处于空白状态。针对这一现状，试验以凌云白毫为原料，在超声波辅助作用下提取总酚类物质，优化提取工艺，并探讨总酚的抗氧化活性，对比同类型品牌茶叶、评估凌云白毫的品质，为扩大凌云白毫在国内的知名度及受众范围提供数据支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

凌云白毫（绿韵有机绿茶，广西凌云浪伏茶叶有限公司）。

没食子酸、福林酚、1，1-二苯基-2-苦肼基自由基（DPPH）、抗坏血酸、无水碳酸钠、硫酸亚铁、水杨酸、30%过氧化氢等（均为国产分析纯）。

FW80高速多功能粉碎机（南京晓晓仪器设备有限公司）；UV-27000岛津紫外可见分光光度计[岛津企业管理（中国）有限公司]；820DP480W数显功率可调超声波（深圳市光点超声波设备有限公司）；SHA-B恒温水浴振荡器（浙江力辰仪器科技有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 凌云白毫总酚的提取及含量测定

1.2.1.1 没食子酸标准曲线的绘制

分别移取0.00，0.50，1.00，1.50，2.00，2.50和3.00 mL 1.000 mg/mL没食子酸标准品溶液置于7个50 mL容量瓶，用蒸馏水定容。再次转移上述不同浓度的没食子酸测试液各1.00 mL置于7个25 mL容量瓶，加入5.00 mL 10%福林酚溶液，于25 ℃振荡5 min。继续加入4.00 mL 7.5%碳酸钠溶液，用蒸馏水定容。振荡60 min后，于765 nm测定体系吸光度A[6]，并以其对没食子酸质量浓度cA（mg/mL）进行线性回归，得没食子酸标准曲线方程：A=121.5cA+0.008 2，R2=0.991 2。

1.2.1.2 总酚的提取及含量测定

称取凌云白毫粉末样品（0.250 mm，基准量0.200 0 g），按一定比例混合乙醇-水溶液，在预先设定好的超声时间、提取温度及超声功率等条件下超声提取，反复2次。合并提取液并浓缩至30 mL，滤至50 mL容量瓶中，用蒸馏水定容即得凌云白毫总酚提取液[7]。按照1.2.1.1小节所示流程测定总酚提取液吸光度，代入没食子酸标准曲线方程计算总酚质量浓度col（mg/mL），并按式（1）计算总酚提取率。

式中：col为总酚质量浓度，mg/mL；V为总酚提取液体积，mL；m为茶叶样品质量，mg。

1.2.2 单因素试验

准确称取0.200 0 g凌云白毫粉末样品，固定超声时间20 min、提取温度70 ℃、液料比40∶1（mL/g）、超声功率160 W，测定总酚在不同乙醇体积分数（50%，60%，70%，80%和90%）下的提取率；固定乙醇体积分数70%、提取温度70 ℃、液料比40∶1（mL/g）、超声功率160 W，测定总酚在不同超声时间（20，25，30，35和40 min）下的提取率；固定乙醇体积分数70%、超声时间20 min、液料比40∶1（mL/g）、超声功率160 W，测定总酚在不同提取温度（60，70，80，90和100 ℃）下的提取率；固定乙醇体积分数70%、超声时间20 min、提取温度70 ℃、超声功率160 W，测定总酚在不同液料比[20∶1，30∶1，40∶1，50∶1和60∶1（mL/g）]下的提取率；固定乙醇体积分数70%，超声时间20 min、提取温度70 ℃、液料比40∶1（mL/g），测定总酚在不同超声功率（100，120，140，160和200 W）下的提取率[8]。

1.2.3 凌云白毫总酚提取工艺的响应面优化

依据试验测得的总酚单因素试验结果，选取其中显著影响总酚提取效果的因素并截取主要水平，以总酚提取率为响应值，利用Design-Expert软件中的Box- Behnken法优化提取方案[9-10]，如表1所示。

表1 Box-Behnken法优化试验方案

1.2.4 凌云白毫总酚的纯化

称取5 g已预处理的XDA-5大孔树脂于250 mL反应瓶中，加入50 mL总酚提取液，于25 ℃振荡24 h。大孔树脂吸附饱和后，经抽滤、洗涤转移至另一洁净的250 mL反应瓶中，加入100 mL 70%乙醇-水溶液，于25 ℃振荡直至总酚完全解吸附[11]。抽滤，测定滤液中总酚质量浓度并配制不同质量浓度（10，20，30，40和50 μg/mL）的总酚待测液。

1.2.5 凌云白毫总酚体外抗氧化活性测试

1.2.5.1 总酚对·OH清除效果的测定

向5支装有2.00 mL不同质量浓度总酚待测液的洁净试管中依次加入2.00 mL 8.000 mol/L硫酸亚铁溶液、2.00 mL 9.000 mol/L水杨酸-乙醇溶液，混合均匀后继续加入2.00 mL 1.0%过氧化氢-水溶液。于25 ℃振荡1 h，在510 nm处测定体系吸光度Mx[12]。相同的试验流程，蒸馏水代替总酚待测液作空白体系并测定M0（空白吸光度）；蒸馏水代替过氧化氢溶液作对照体系并测定Mp（对照吸光度），按式（2）计算凌云白毫总酚对·OH的清除率。

1.2.5.2 总酚对DPPH自由基清除效果的测定

向5支装有2.00 mL不同质量浓度总酚待测液的洁净试管中加入2.00 mL 1.000×10-5mol/L DPPH-乙醇溶液。在黑暗环境中，该体系于25 ℃振荡40 min，在290 nm处测定体系吸光度Px[13]。相同的试验流程，无水乙醇代替总酚待测液作空白体系并测定P0；以无水乙醇代替DPPH-乙醇溶液作对照体系以测定Pp，按式（3）计算凌云白毫总酚对DPPH自由基的清除率。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 乙醇体积分数对总酚提取率的作用效果

如图1所示，总酚提取率在乙醇体积分数＜70%时随其增加而升高，而后迅速下降。当乙醇体积分数为70%时，总酚提取率为13.35%，为所测最高值。因而，乙醇体积分数设定为70%比较合适。

图1 总酚提取率随乙醇体积分数的变化趋势

2.1.2 超声时间对总酚提取率的作用效果

如图2所示，总酚提取率在超声时间＜25 min时随其增加而升高，而后有所下降。当超声时间为25 min时，总酚提取率为12.70%，为所测最高值。因而，超声时间设定为25 min比较合适。

图2 总酚提取率随超声时间的变化趋势

2.1.3 提取温度对总酚提取率的作用效果

如图3所示，总酚提取率在提取温度＜80 ℃时随其增加而升高，而后迅速下降。当提取温度为80 ℃时，总酚提取率为13.15%，为所测最高值。因而，提取温度设定为80 ℃比较合适。

图3 总酚提取率随提取温度的变化趋势

2.1.4 液料比对总酚提取率的作用效果

如图4所示，总酚提取率随液料比的增加而升高并最终趋近于平衡状态。当液料比为50∶1（mL/g）时，总酚提取率为12.88%，为所测最高值。因而，液料比设定为50∶1（mL/g）比较合适。

图4 总酚提取率随液料比的变化趋势

2.1.5 超声功率对总酚提取率的作用效果

如图5所示，总酚提取率在超声功率＜160 W时随其增加而升高，而后开始下降。当超声功率为160 W时，总酚提取率为9.7%，为所测最高值。因而，超声功率设定为160 W比较合适。

图5 总酚提取率随超声功率的变化趋势

2.2 凌云白毫总酚提取工艺的响应面优化

2.2.1 响应面法设计优化试验方案

根据单因素试验结果，超声功率为次要因素。令总酚提取率为响应值（Y），乙醇体积分数（A）、超声时间（B）、提取温度（C）及液料比（D）为自变量，利用Design-Expert软件优化试验方案。试验方案及结果如表2所示。

表2 优化试验方案及结果

2.2.2 回归模型的方差分析

以表2中结果为依据，利用Design-Expert 8.0.5软件对其进行回归分析，获得凌云白毫总酚提取率（Y）对所考察4个因素的回归模型：

表3为该回归模型的方差分析结果[14-15]。该模型p＜0.000 1，极显著；失拟项p=0.152 4＞0.05，不显著，说明未考察因素对所得数据的影响可忽略，随机误差是生成残差的主要诱因。决定系数R2=0.969 7，校正系数Radj2=0.939 4，可知该模型能够良好地匹配实际操作过程。

表3 方差分析表

所考察因素及其二次项可极显著影响总酚提取率（p＜0.01），影响效果的显著顺序为A＞C＞B＞D。此外，各因素间存在交互作用，其中交互作用AB极显著（p＜0.01），交互作用BC、CD显著（p＜0.05），其他交互作用AC、AD、BD不显著（p＞0.05）。

2.2.3 凌云白毫总酚提取工艺最佳参数的确定

利用Design-Expert对回归模型进行最优化处理，获取凌云白毫总酚提取工艺的最佳条件：乙醇体积分数78%、超声时间21 min、提取温度81 ℃、液料比46∶1（mL/g）、超声功率160 W。在此条件下平行试验5次，实测凌云白毫总酚平均提取率为19.26%，与模型预测值19.78%相当（＜3%），说明所得凌云白毫总酚的提取工艺条件合理、可行。

2.3 凌云白毫总酚体外抗氧化活性测试

2.3.1 总酚对·OH清除效果的测定

如图6所示，总酚对·OH具良好的清除效果，其清除能力随总酚质量浓度的升高而增强，并且在高质量浓度条件下清除率增速进一步加快。当总酚质量浓度为50 μg/mL时，其对·OH的清除率可达84.92%，略高于西湖龙井总酚对·OH的清除能力，低于VC对·OH的清除能力。

图6 总酚对·OH清除效果的测定

2.3.2 总酚对DPPH自由基清除效果的测定

如图7所示，总酚对DPPH自由基具有较好的清除效果，其清除能力随总酚质量浓度的升高而增强并逐渐趋近于平衡状态。当总酚质量浓度为50 μg/mL时，其对DPPH自由基的清除率可达75.74%，略高于西湖龙井总酚对DPPH自由基的清除能力，低于VC对DPPH自由基的清除能力。

图7 总酚对DPPH自由基清除效果的测定

3 结论

试验以凌云白毫（绿茶）为原料，在超声波作用下提取其中的总酚类物质。依据单因素试验结果，结合响应面法优化提取方案，获取该工艺的最佳条件：乙醇体积分数78%，超声时间21 min，提取温度81 ℃，液料比46∶1（mL/g），超声功率160 W。在此条件下实测总酚提取率为19.26%，与回归模型预测值19.78%相当（＜3%），说明该工艺具有较高的使用价值。抗氧化活性测试表明总酚具有良好的抗氧化活性，其抗氧化能力随总酚质量浓度的升高而增强。当总酚质量浓度为50 μg/mL时，其对OH、DPPH的清除率分别可达84.92%和75.74%。该研究丰富了凌云白毫主要功能性物质总酚的提取及抗氧化活性等方面的研究内容，为强化凌云白毫茶在国内范围的推广提供一定的理论依据及数据支撑。