沙棘叶总黄酮闪式提取工艺优化及组分鉴定

张存存，张娟，谭志超*，柳嘉，王永霞

1. 张北宝得康食品有限公司（张家口 076450）；2. 中国食品发酵工业研究院有限公司（北京 100015）；3. 河北工程大学（邯郸 056038）

中国沙棘（Hippophae rhamnoidessubsp.sinensisRousi），是胡颓子科沙棘属植物沙棘（Hippophae rhamnoidesL.）的一个亚种，沙棘叶含有丰富的黄酮类成分[1-2]。研究表明，沙棘黄酮有很高的保健价值和药用价值，具有抗心肌缺血[3]、抗氧化[4-6]、抗衰老[7]、抗疲劳[8]、抗肿瘤[9]、抗菌[10]、降血脂[11]、降血糖[12]等作用。

沙棘总黄酮常用的提取方法有溶剂浸提[13]、酶提取[14]、超声辅助提取[15]和微波辅助提取[16]等。研究[17]表明，沙棘叶黄酮提取物对高温比较敏感，溶剂浸提不仅温度高且耗时[13]，酶提取和超声辅助提取法也比较耗时[14-15]，至少需要数十分钟，而微波辅助法提取[16]有微波泄露从而危害人体健康的风险[18-19]。闪式提取技术是利用高速剪切头形成高强度的剪切力，植物细胞被迅速破壁，并利用强力搅拌，使溶剂快速渗透，有效成分迅速扩散，具有提取时间短、温度低、无辐射风险的优点[20-21]。闪式提取技术在无花果[22]、山楂果核[23]、马鞭草[24]等总黄酮提取方面已有研究，但还未见对提取沙棘总黄酮的研究。

试验用闪式法从沙棘叶中提取总黄酮，并优化闪式提取工艺，以期为中国沙棘工业化加工提供指导、为沙棘总黄酮研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

沙棘叶（落地叶，品种为中国沙棘亚种，张北宝德康食品有限公司）。

食用酒精（95%，梅河口市阜康酒精有限责任公司）；芦丁标准品（纯度≥95%，北京北纳创联生物技术研究院）；杨梅素、槲皮素、异鼠李素、山奈酚标准品（纯度≥98%，北京北纳创联生物技术研究院）；氢氧化钠、硝酸铝、亚硝酸钠、无水乙醇、甲醇、磷酸、盐酸（分析纯，国药集团化学试剂北京有限公司）；去离子水。

1.2 仪器与设备

JHBE-50T闪式提取器（河南智晶生物科技股份有限公司）；UV-1800紫外-可见分光光度计[岛津仪器（苏州）有限公司]；DZF-6090真空干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）；KC-500高速粉碎机（北京开创同和科技发展有限公司）；TDL-5-A离心机（上海安亭科学仪器厂）；ESJ120-4电子天平（沈阳龙腾电子秤量仪器有限公司）；KQ3200ES超声波清洗机（昆山市超声仪器有限公司）；DZKW-4电子恒温水浴锅（北京中兴伟业仪器有限公司）；1220 LC高效液相色谱（安捷伦科技有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 原料预处理

沙棘叶于60 ℃真空烘箱中真空干燥，用高速粉碎机粉碎，过0.850 mm（20目）筛，留筛下物备用。

1.3.2 提取工艺流程

配制乙醇水溶液，量取3 L，并称取适量预处理过的沙棘叶粉末，混合均匀，将闪式提取器的剪切头完全浸没，开启闪式提取器，旋转提取电压调节旋钮，待提取电压达到需求值时，开始计时；计时结束，先旋转提取电压调节旋钮，提取电压完全降为零时，关闭提取器，提取结束，料液按4 000 r/min离心30 min，得到粗提液备用。

1.3.3 沙棘叶闪式提取工艺单因素试验

预处理过的沙棘叶粉末按照以下工艺参数闪式提取，得到粗提液，测定粗提液中总黄酮含量，考察各因素对沙棘总黄酮得率的影响。

1.3.3.1 提取电压的影响

液料比（V乙醇∶m沙棘叶）10∶1 mL/g，加入60%乙醇-水溶液，提取电压分别设置为100，120，140，160，180和200 V，提取时间120 s。

1.3.3.2 提取时间的影响

液料比（V乙醇∶m沙棘叶）10∶1 mL/g，加入60%乙醇-水溶液，电压200 V，提取时间分别设置为30，60，90，120，150，180和210 s。

1.3.3.3 乙醇体积分数的影响

液料比（V乙醇∶m沙棘叶）10∶1 mL/g，分别加入乙醇体积分数为30%，40%，50%，60%，70%和80%乙醇-水溶液，提取电压200 V，提取时间120 s。

1.3.3.4 液料比的影响

液料比（V乙醇∶m沙棘叶）分别设置为8∶1，10∶1，12∶1，14∶1，16∶1，18∶1和20∶1 mL/g，加入60%乙醇-水溶液，提取电压200 V，提取时间120 s。

1.3.4 正交试验优化提取工艺

根据单因素试验结果，选取提取电压、提取时间、乙醇体积分数、液料比4个因素及其对应的3个较优水平，以总黄酮提取得率为考察指标设计L9(34)正交试验表，每组试验做3次计算沙棘总黄酮平均得率。

1.3.5 与传统提取工艺的比较

根据康莹[12]优选传统的乙醇浸提法提取沙棘叶总黄酮，乙醇体积分数59%，液料比（V乙醇∶m沙棘叶）18∶1 mL/g，提取温度79 ℃，提取时间125 min，料液按4 000 r/min离心30 min，得到粗提液备用。按照1.3.6的方法测定粗提液中总黄酮含量，并计算提取得率，按照1.3.7的方法测定粗提液中总黄酮组分，并与试验优化的闪式提取工艺作比较，从总黄酮提取得率和粗提物组分两方面进行比较。

1.3.6 总黄酮含量的测定

采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色的方法。

1.3.6.1 标准曲线的绘制按照文献[25]的方法绘制标准曲线，如图1所示。

图1 芦丁标准曲线

1.3.6.2 总黄酮含量的测定

精密量取2～5 mL粗提液，用30%乙醇稀释至25 mL，作为供试品溶液。按照文献[25]测定总黄酮含量，总黄酮以芦丁计。

1.3.6.3 总黄酮提取得率计算

式中：y为总黄酮提取得率，mg/g；c为待测液中总黄酮质量浓度，μg/mL；N为稀释倍数；V为粗提液体积，mL；m为提取原料质量（以预处理完的干基计），g。计算结果保留2位有效数字。

1.3.7 粗提物组分鉴定HPLC法[25]

1.3.7.1 色谱条件

Agilent TC-C18（2）（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱；流动相：流动相为甲醇-0.4%磷酸（V甲醇∶V0.4%磷酸=55∶45）；流速1 mL/min；柱温25 ℃；检测波长370 nm；进样量20 μL。

1.3.7.2 标准品溶液

精密称取10 mg杨梅素、槲皮素、山奈酚、异鼠李素对照品分别置于25 mL量瓶中，用60%甲醇超声溶解，定容至25 mL，得到4种黄酮对照品母液。各吸取0.5 mL置于样品瓶中，混匀，取续滤液进样，得到黄酮混合对照品HPLC色谱图。

1.3.7.3 粗提液黄酮类组分鉴定

取25 mL粗提液续滤液，加3.5 mL浓盐酸，于75 ℃水解1 h；冷却，用60%乙醇定容至50 mL；过滤，取续滤液进样，得到粗提液HPLC色谱图。

1.3.8 数据分析

每组试验重复3次，取平均值，用SPSS AU 20.0进行方差分析和LSD法多重比较，p＜0.05具有显著差异，p＜0.01具有极显著差异，利用Microsoft Office Excel 2007进行制图。结果以“平均值±标准差”表示。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 提取电压对提取得率的影响

由图2可看出，随着提取电压增大，总黄酮提取得率随之增大，提取电压大于160 V，提取得率增加不再显著，增势趋缓。这是因为提取电压越大，设备的刀头旋转越快，剪切和搅拌作用越强，所以沙棘叶组织内的成分向外渗透越快，组织内外的物质浓度越快达到一致。从提取效果、能耗等方面综合考虑，选取提取电压160 V左右为宜。

图2 提取电压对沙棘叶总黄酮提取得率的影响

2.1.2 提取时间对提取得率的影响

由图3可看出，总黄酮提取得率随着闪式提取时间延长而增大，提取时间超过150 s时，提取得率增加不显著。这是因为沙棘叶细胞中的成分渗透到溶剂中需要时间，提取时间越长，渗透扩散越充分，但是植物组织内外物质浓度趋于一致时，渗透速度减缓，溶剂中总黄酮浓度趋于平衡。综合考虑提取效果和能耗，最佳提取时间选择150 s。

图3 提取时间对沙棘叶总黄酮提取得率的影响

2.1.3 乙醇体积分数对提取得率的影响

由图4可看出，乙醇体积分数对总黄酮提取得率影响较大，乙醇体积分数60%左右时，提取得率最大，体积分数再增加，提取得率反而下降。这可能由于不同体积分数的乙醇-水溶液极性不同，若乙醇比例太小，溶液极性太大，更有利于多糖、蛋白质等水溶性的物质溶出，不利于黄酮类成分的溶出，而乙醇比例太大，溶液的极性太小，醇不溶性的物质形成封闭的微小空间，阻碍黄酮类成分的溶出。

图4 乙醇体积分数对沙棘叶总黄酮提取得率的影响

2.1.4 液料比（V乙醇∶m沙棘叶）对提取得率的影响

由图5可看出，随着液料比增大，沙棘总黄酮提取得率增加，但是，液料比达到16∶1 mL/g后，沙棘总黄酮提取得率增加缓慢，提取得率没有显著差异。这是由于提取的过程是植物组织内外的物质浓度趋于一致的平衡过程，液料比越大，平衡时溶剂中的总黄酮含量相对越多，但是液料比达到一定比例后，含量提高越来越不明显，从提高提取效果、节约溶剂方面综合考虑，溶剂用量不宜过大。故适宜液料比为16∶1 mL/g。

图5 液料比对沙棘叶总黄酮提取得率的影响

2.2 正交试验优化闪式提取工艺

根据1.3.4用正交试验优化工艺参数，正交试验设计见表1。

表1 正交试验设计

由表2中的正交试验数据极差分析可知，各因素影响的顺序为A3＞A2＞A1，B3＞B2＞B1，C2＞C3＞C1，D3＞D2＞D1。由表2极差分析和表3多因素方差分析可看出：提取时间对总黄酮提取得率影响最小，乙醇体积分数、提取电压和液料比（V乙醇∶m沙棘叶）对提取得率有显著性影响；闪式提取沙棘叶总黄酮最佳条件为A3B3C2D3，即提取电压180 V、提取时间180 s、乙醇体积分数60%、液料比（V乙醇∶m沙棘叶）18∶1 mL/g。由于延长提取时间对总黄酮的得率提高影响不大，综合考虑节能降耗，选取120 s较好，并且验证试验证明，在正交的最优条件A3B3C2D3，总黄酮得率为20.46±0.28 mg/g，而在A3B1C2D3条件下总黄酮得率为20.32±0.20 mg/g，差距可以忽略不计。

表2 正交试验结果

表3 正交试验方差分析

2.3 与传统浸提工艺的比较

2.3.1 提取得率的比较

根据2.2的试验结果，选取A3B1C2D3工艺参数进行闪式提取，按照1.3.5的方法进行传统浸提。由表4试验数据可知，在同样提取一次的情况下，传统浸提比闪式提取的沙棘叶总黄酮得率要高，但是在同样提取两次的情况下，差距会减小，趋于基本一致。闪式与传统提取法比较，闪式提取有较大的优势，主要表现为保证提取得率的情况下提取时间短，不用加热，常温提取即可。

表4 2种提取方法的提取得率

2.3.2 粗提物组分的比较

沙棘黄酮包含的种类繁多，异鼠李素、山奈酚、杨梅素和槲皮素只是其中含量较多的黄酮种类的苷元，HPLC法定性分析闪式提取和传统浸提粗提液的主要黄酮成分。

在1.3.7色谱条件下，黄酮混合对照品及粗提液经酸水解处理的样品可以得到分离度较好的HPLC谱图（见图6）。图6（A）为黄酮混合对照品色谱图，按照出峰时间从前到后依次是杨梅素、槲皮素、山奈酚和异鼠李素。比较图6B（闪式提取粗提液）和图6C（传统浸提粗提液）发现，峰型和出峰时间未发现明显改变，说明闪式提取法所得物质与传统浸提法无较大差异，主要黄酮苷元组分一致，均含有杨梅素、槲皮素、山奈酚和异鼠李素。

图6 HPLC色谱图

3 结论

通过单因素试验和正交试验，并综合考虑时间、能耗等成本因素，优化闪式提取沙棘叶总黄酮的工艺条件：提取电压180 V、提取时间120 s、乙醇体积分数60%、液料比（V乙醇∶m沙棘叶）18∶1 mL/g。在此条件下，提取得率为20.32±0.34 mg/g，经HPLC法鉴定，粗提物中含有杨梅素、槲皮素、山奈酚和异鼠李素，与传统浸提法相比，总黄酮提取得率和粗提物组分基本一致，但是闪式提取法操作简单，提取时间短，不用加热，常温提取即可，可降低提取成本，有利于沙棘叶总黄酮的稳定。闪式提取过程中高度剪切造成物料细化，增加过滤分离的难度，试验可用离心以分离料液，生产操作中，可用粗滤加卧式离心初步分离料液。

试验原料为中国沙棘亚种的叶子，若扩大研究范围，对其他品种的沙棘叶也进行类似研究，则能验证此次工艺的普适性。用HPLC法对沙棘叶粗提液进行组分鉴定，由于未配合进行质谱分析，所以所得结论有待进一步考究。