碱性蛋白酶酶解芝麻粕制备蛋白肽的工艺优化

邵家威 ，汪慧慧，李庆腾，张桂香张炳文*，王明辉

1. 济南大学食品科学与营养系（济南 250000）；2. 山东百脉泉酒业股份有限公司，食品发酵工程研究中心（济南 250200）

芝麻（Sesamum indicumLinn.），又称油麻、脂麻，是人类生产食用最早的胡麻科油料作物[1-2]。研究发现，芝麻中蛋白质和脂肪含量高达21.9%和61.7%，同时因其蕴含丰富的Fe、Ca等矿物质，有“全能营养库”“八谷之冠”之美誉[3-4]。芝麻饼粕是芝麻经过榨油之后得到的副产物，含有大量的蛋白质[5-6]。低温加工制油会极大保留芝麻油中的生物活性成分，可使芝麻粕中蛋白质资源不被破坏，增加产业链高值化利用[7]。生物活性肽是具有多种生物学功能的多肽，在人体中发挥重要的生理调节作用，例如与矿物质结合、参与体内免疫调节、抑菌、抗氧化、溶解血栓、降低胆固醇和降血压作用[8-9]。该试验研究了碱性蛋白酶酶解亚临界芝麻粕对芝麻蛋白肽制备得率的影响，并通过响应面法对其参数进行模型优化，以期为芝麻粕的深加工研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

亚临界芝麻粕（SSM、粗蛋白含量为37.22%，河南省亚临界生物技术有限公司）。

无水乙醇、HCl、H2SO4、硼酸、甲基红、溴甲酚绿、亚甲基蓝、氢氧化钠、三氯乙酸、硫酸铜（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；Gly-Gly-Tyr-Arg标准品（Sigma公司）；碱性蛋白酶（上海源叶生物有限公司）。

1.2 仪器与设备

WZJ-6J振动式药物超微粉碎机（济南倍力粉技术工程有限公司）；PHS-3B pH酸度计（赛多普利斯科学仪器有限公司）；702A紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限公司）；GZX-9240MBE电热鼓风干燥箱（上海博涵实业有限公司设备厂）；TGL-16M冷冻医用离心机（湘仪离心机仪器有限公司）；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器（上海互佳仪器有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 原料预处理

将SSM于50 ℃烘干至恒重，粉碎至0.425 mm，置于自封袋中保存备用。

1.3.2 绘制Gly-Gly-Tyr-Arg四肽标准曲线

参考鲁伟等[10]的方法，采用双缩脲法测定多肽含量。分别精确配制0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6和1.8 mg/mL四肽标准溶液（5% TCA定容）。分别取6 mL标准溶液，然后加入4 mL双缩脲试剂，涡旋混匀静置10 min，在2 000 r/min、4 ℃条件下离心10 min，取上清液于540 nm测定吸光度。以吸光度（A）为纵坐标、多肽含量（mg/mL）为横坐标，得回归方程：y=0.140 2x-0.003 2，R2=0.995 4。

1.3.3 肽得率测定

将2.5 mL样品溶液与2.5 mL 10% TCA溶液充分混匀，静置10 min后在4 000 r/min、4 ℃条件下离心15 min。然后将上清液移入25 mL容量瓶中，用5% TCA定容，摇匀后备用。取6 mL上述溶液于试管中，然后按照1.3.2小节测定吸光度，将其代入标准曲线，按式（1）计算肽得率。

式中：Y为肽得率，%；C为样品溶液的质量，mg；M为样品干质量，mg；V1为反应体积，mL；V2为样品体积，mL；V3为定容体积，mL；V4为取样体积，mL。

1.3.4 碱性蛋白酶酶解制备芝麻蛋白肽

称取烘干恒重后的芝麻粕，加入适量水配制成2%（以粗蛋白计）的SSM浆液，pH调至10，加入10 000 U/g底物的碱性蛋白酶，于50 ℃反应1 h。然后置于沸水浴10 min，在8 000 r/min、4 ℃条件下离心30 min，取上清液测定肽得率。

1.3.5 不同因素对碱性蛋白酶酶解制备芝麻蛋白肽的影响

1) SSM粒度对肽得率的影响。选取原粉以及0.425，0.180和0.075 mm粒径的SSM粉，在底物浓度2%、pH 10、加酶量10 000 U/g底物、温度50 ℃、酶解时间1 h的条件下，研究粒度对肽得率的影响。

2) 底物浓度对肽得率的影响。选取底物浓度1%，2%，3%，4%，5%和6%，在0.425 mm SSM粉、pH 10、加酶量10 000 U/g底物、温度50 ℃、酶解时间1 h的条件下，研究底物浓度对肽得率的影响。

3) 温度对肽得率的影响。选取温度30，40，50，60和70 ℃，在0.425 mm SSM粉、底物浓度2%、pH 10、加酶量10 000 U/g底物、酶解时间1 h的条件下，研究温度对肽得率的影响。

4) 加酶量对肽得率的影响。选取加酶量4 000，6 000，8 000，10 000，12 000和14 000 U/g底物，在0.425 mm SSM粉、底物浓度2%、温度50 ℃、pH 10、酶解时间1 h的条件下，研究加酶量对肽得率的影响。

5) pH对肽得率的影响。选取pH 9.0，9.5，10.0，10.5，11.0和11.5，在0.425 mm SSM粉、底物浓度2%、温度50 ℃、加酶量10 000 U/g底物、酶解时间1 h的条件下，研究pH对肽得率的影响。

6) 酶解时间对肽得率的影响。选取酶解时间0.5，1，1.5，2和2.5 h，在0.425 mm SSM粉、底物浓度2%、温度50 ℃、加酶量10 000 U/g底物、pH 11.0的条件下，研究酶解时间对肽得率的影响。

1.3.6 模型优化工艺设计

在单因素试验的基础上，选取温度、加酶量、pH、酶解时间为考察因素，以芝麻多肽得率为响应值进行Box-Behnken的中心组合设计，见表1。通过Design Expert软件进行数据分析和试验设计，优化碱性蛋白酶酶解SSM制备芝麻蛋白肽的工艺条件。

表1 Box-Behnken的中心组合因素水平

2 结果与讨论

2.1 不同因素对碱性蛋白酶酶解制备SSM多肽的结果分析

2.1.1 SSM粒度对肽得率的影响

如图1所示，随着SSM粒度的不断增大，SSM多肽得率变化较为不显著。当SSM未进行粉碎时，多肽得率为8.53%±0.07%；利用0.425 mm SSM粉进行制备多肽时的得率为8.93%±0.12%，增加了0.4个百分点。当利用0.075 mm SSM粉时，多肽得率为9.46%± 0.16%，比利用0.425 mm和0.180 mm SSM粉分别增加了0.53和0.39个百分点。由此看出，SSM粒度对多肽得率影响较小；这是因为物料粒度越小，与溶剂间的接触面积就越大，其中的蛋白质溶出速度可能会增加，但蛋白质中的酶切位点是一定的，不会随粒度变化而增加或减少。因此，SSM粒度对多肽得率影响不大，但全面考虑试验过程，采用0.425 mm SSM粉进行后续试验。

图1 SSM粒度对肽得率的影响

2.1.2 底物浓度对肽得率的影响

如图2所示，随着底物浓度的增大，SSM多肽的得率呈现下降趋势。当底物浓度为2%时，多肽得率为9.07%±0.30%，较底物浓度为1%时的多肽降低了0.2个百分点；较底物浓度为3%时的多肽得率高1.17个百分点；当底物浓度为6%时，多肽得率最低，为6.33%±0.02%。这可能是因为，在底物浓度增加后，原料中一些植酸类物质会加剧对蛋白酶的抑制作用。出于节省成本的目的，后续试验中采用的底物浓度条件为2%。

图2 底物浓度对肽得率的影响

2.1.3 温度对肽得率的影响

如图3所示，随着温度的不断提高，SSM多肽得率呈现先升高后下降的趋势。酶解反应温度从30 ℃升高至50 ℃区间内，多肽得率急剧升高，在温度为50 ℃时达到最高值9.09%±0.03%，较温度为30 ℃时增加3.39个百分点。在酶解反应温度达到60 ℃时，多肽得率达到8.43%±0.18%，下降了0.66个百分点；当反应温度为70 ℃时，多肽得率最低。碱性蛋白酶作为一种酶制剂来说，在酶解反应时都会有一个最适温度，在此试验中可明显看出反应温度50 ℃是该蛋白酶的最适温度。因此确定反应温度50 ℃，为碱性蛋白酶酶解SSM制备多肽的最佳工艺条件。

图3 酶解温度对肽得率的影响

2.1.4 加酶量对肽得率的影响

如图4所示，蛋白酶添加量对多肽得率的影响较大，呈现先上升后下降的趋势。加酶量为10 000 U/g底物时，得率达到峰值9.03%±0.03%。加酶量为4 000～ 10 000 U/g底物时，随着蛋白酶的增加，多肽得率逐渐升高。加酶量大于10 000 U/g底物以后，多肽得率反而急剧下降，可能是在相同单位时间的情况下，随着蛋白酶添加量增大，底物减少导致多肽被进一步酶解成为氨基酸，导致多肽得率减少[11]。因此，选择蛋白酶添加量10 000 U/g底物，进行下一步试验优化。

图4 蛋白酶添加量对肽得率的影响

2.1.5 pH对肽得率的影响

如图5所示，pH对多肽得率的影响较为显著。当pH从9.0增大至11.0时，多肽得率不断上升，并达到最大值10.04%±0.07%；当pH大于11.0时，多肽得率略有下降；因此体系pH 11.0是该反应的最适pH。所以选取pH 11.0为下一步优化试验的酶解pH。

图5 pH对肽得率的影响

2.1.6 酶解时间对肽得率的影响

如图6所示，酶解反应时间对多肽得率的影响较大，呈现先上升再下降的趋势。反应时间为2 h（120 min）时，得率达到峰值12.18%±0.18%。反应时间为0.5～2 h时，随着酶解反应时间的增加，多肽得率逐渐升高。反应时间大于2 h以后，多肽得率下降，可能是因为随着酶解反应的进行，底物逐渐减少，产物不断积累对蛋白酶产生抑制作用。因此，碱性蛋白酶酶解制备芝麻蛋白肽的反应时间的最佳条件是2 h（120 min）。

图6 反应时间对肽得率的影响

2.2 响应面试验结果分析

2.2.1 响应面结果分析

试验研究加酶量、温度、pH、酶解时间4个单一因素对碱性蛋白酶酶解SSM制备芝麻蛋白肽得率的影响，通过Box-Behnken试验设计出29个试验，5个中心点重复试验用来预测试验的误差，试验设计与结果见表2。

表2 响应面分析设计及结果

2.2.2 二次回归模型拟合及方差分析

通过设计分析试验，得到各个因素之间相互作用的响应面图。各个因素经过回归拟合，得到加酶量、温度、pH、酶解时间对碱性蛋白酶酶解SSM制备芝麻蛋白肽得率的二次多项回归方程：Y=12.34-0.39A-0.47B+0.18C+0.075D-0.030AB+0.27AC+0.077AD-0.22BC+0.13BD-0.095CD-1.35A2-1.18B2-0.99C2-0.75D2。

对表2数据进行回归分析，结果见表3。由表3得出，模型p＜0.000 1，表明该模型显著，失拟项p= 0.091 8＞0.05，说明失拟项不显著。模型确定系数R2较高（R2=0.910 1），则说明这个回归方程的近似模拟性比较好，能够较为真实地反映实际情况，实测值和预测值的拟合度比较好。综上所述，此模型可用于碱性蛋白酶酶解SSM制备芝麻蛋白肽的条件的分析和预测。由表3方差分析结果得出，模型中的二次项A2、B2、C2对试验结果的影响极其显著（p＜0.000 1），即表示蛋白酶添加量、pH和温度三因素的二次项对多肽得率具有较为显著的影响。

表3 回归方程系数及显著性检测

2.2.3 响应面交互作用分析

通过响应面垂直曲面的陡峭程度可以直观反映因素之间交互作用对碱性蛋白酶酶解制备SSM多肽得率的影响，等高线的等高差额可以反映各因素之间交互作用的强弱。根据图7分析，根据陡峭程度，程度从高到低为pH＞加酶量＞温度＞酶解时间，因此各因素对SSM多肽得率影响顺序为pH＞加酶量＞温度＞酶解时间。以上分析皆同试验模型方差分析结论相吻合。

图7 各因素两两交互影响响应曲面

2.2.4 碱性蛋白酶酶解制备SSM多肽的工艺条件确定与验证

为进一步改进SSM多肽的酶解制备最佳试验条件，利用Design Expert软件设计结果SSM多肽制备的最优试验参数：pH 10.9、蛋白酶添加量9 700 U/g底物、温度51 ℃、反应时间2 h。因此确定碱性蛋白酶酶解制备SSM多肽的最佳工艺：SSM粒度0.425 mm、底物浓度2%、pH 10.9、蛋白酶添加量9 700 U/g底物、温度51 ℃、反应时间2 h。

为了进一步检测响应面法得到的结果是否科学，在试验确定的最优参数下，进行平行试验。结果显示，SSM多肽的得率是12.38%±0.13%，与12.34%这一理论值接近，说明利用响应面得到的模型能很好地体现出碱性蛋白酶酶解制备SSM多肽的工艺条件。

3 结论

以亚临界芝麻粕（SSM）为原料，以多肽得率为指标，通过探究相关因素对碱性蛋白酶酶解SSM的影响，并通过响应面法优化提取条件，得出最佳制备工艺条件：SSM粒度0.425 mm、底物浓度2%、pH 10.9、蛋白酶添加量9 700 U/g底物、温度51 ℃、反应时间2 h，在此条件下得率为12.38%±0.13%。研究结果表明，芝麻粕中丰富的蛋白资源具有较好的开发价值，为进一步研究芝麻蛋白肽提供了理论基础。