醉茄素A通过circOSBPL10/miR-128-3p通路调控乳腺癌MDA-MB-231细胞糖酵解、增殖、迁移及侵袭的机制研究

樊倩，杨程，刘云霓

（华中科技大学同济医学院附属武汉市中心医院甲乳外科，武汉 430000）

乳腺癌是威胁女性生命安全的恶性肿瘤之一，中国乳腺癌发病率与病死率呈增长趋势，既往研究证实，植物提取物具有抗肿瘤的作用，西黄丸、小檗碱等可抑制乳腺癌细胞增殖及促进细胞凋亡进而发挥抗乳腺癌的作用[1-3]。醉茄素A是茄科植物醉茄中提取的主要活性成分，具有抗炎、抗肿瘤的作用，并可抑制胆囊癌细胞增殖及诱导细胞凋亡[4]。环状RNA（circRNA）是3’端与5’端以共价键结合形成的RNA分子，其具有组织特异性与结构稳定性等特点，研究表明circOSBPL10在胃癌组织中上调表达，沉默其表达可抑制胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭[5]。靶基因预测显示circOSBPL10与miR-128-3p存在结合位点，miR-128-3p通过靶向LIMK1抑制乳腺癌发展进程[6]。但醉茄素A是否通过circOSBPL10/miR-128-3p通路调控乳腺癌MDA-MB-231细胞糖酵解、增殖、迁移和侵袭目前还尚未可知。因此，本研究主要探讨醉茄素A对乳腺癌MDA-MB-231细胞糖酵解、增殖、迁移、侵袭的影响及其对circOSBPL10/miR-128-3p通路的调控作用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 醉茄素A购自美国Sigma公司；乳腺癌细胞MDA-MB-231购自美国ATCC公司；DMEM培养基、胎牛血清购自美国Gibco公司；Lipofectamine2000购自美国Invitrogen公司；miR-128-3p寡核苷酸模拟物（miR-128-3p mimics）及阴性对照mimic NC序列（miR-NC）、circOSBPL10小分子干扰RNA（si-circOSBPL10）及阴性对照序列（si-NC）购自广州锐博生物科技有限公司；pcDNA与circOSBPL10过表达载体pcDNA-circOSBPL10购自上海远慕生物科技有限公司；Trizol试剂、反转录试剂、SYBR Green试剂购自美国Thermo Fisher公司；噻唑蓝（MTT）试剂、Matrigel基质胶、葡萄糖、丙酮酸激酶与乳酸含量检测试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；己糖激酶检测试剂盒购自上海信帆生物；Transwell小室购自美国Corning公司；荧光素酶活性检测试剂及其系统购自美国Promega公司；兔抗人蛋白细胞增殖核抗原-67（Ki-67）、基质金属白酶-2（MMP-2）、基质金属白酶-9（MMP-9）抗体购自美国CST公司；辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司。Multiskan Mk3酶标仪购自美国Thermo Fisher公司；电泳仪购自美国BioRad公司；StepOnePlus实时荧光定量聚合酶链反应（qRt-PCR）仪购自美国ABI公司。

1.2 方法

1.2.1 实验分组 取对数生长期MDA-MB-231细胞（1×105个/mL）接种于 96 孔板（100 μL/孔），分别加入不同浓度（10、20、40 μg/mL）的醉茄素 A 预处理细胞24 h[7]，分别记为醉茄素A低剂量组、醉茄素A中剂量组、醉茄素A高剂量组。同时将正常培养的细胞作为对照组。

1.2.2 细胞转染 细胞转染用不含血清的培养液稀释si-NC、si-circOSBPL10后作为A液，用不含血清的培养液稀释Lipofectamine2000后作为B液，A液与B液充分混匀后室温孵育20min，将其加入MDAMB-231细胞中，分别记为si-NC组、si-circOSBPL10组。回复实验：pcDNA、pcDNA-circOSBPL10分别转染入MDA-MB-231细胞后加入40 μg/mL的醉茄素A处理细胞24 h，分别记为醉茄素A+pcDNA组、醉茄素A+pcDNA-circOSBPL10组。

1.2.3 检测葡萄糖消耗、乳酸产生 收集“1.2.1”各分组MDA-MB-231细胞后经3 000 r/min转速离心，弃上清液，加入1 mL蒸馏水后应用超声波破碎细胞，根据试剂盒说明书检测葡萄糖消耗与乳酸产生量。

1.2.4 MTT检测细胞增殖 收集各组MDA-MB-231细胞（1×105个/mL）接种于 96孔板（100 μL/孔），每孔加入质量浓度为5 mg/mL的MTT溶液20 μL，于培养箱内继续培养4 h后弃上清，将DMSO加入96孔板（150 μL/孔），室温避光孵育 5 min后应用酶标仪检测各孔吸光度值（OD 490 nm）并计算细胞增殖抑制率[（对照组OD-实验组OD）/（对照组OD-空白组 OD）×100%]。

1.2.5 Transwell实验检测细胞迁移与侵袭 收集各组MDA-MB-231细胞加入0.25%胰蛋白酶消化后加入培养液制备细胞悬液（2.5×105个/mL），将其加入小室的上室（200 μL/孔），下室加入 600 μL 含有10%胎牛血清的培养液，于培养箱内继续培养24 h后采用多聚甲醛溶液固定20 min，采用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤后加入0.1%结晶紫染液染色10 min，应用显微镜观察迁移细胞数。采用预冷培养液稀释Matrigel基质胶后加入小室的上室（40 μL/孔），于培养箱内继续培养5 h后加入各组MDA-MB-231细胞悬液，后续实验步骤同细胞迁移实验，应用显微镜观察侵袭细胞数。

1.2.6 qRT-PCR检测细胞中 circOSBPL10、miR-128-3p的表达水平 采用Trizol法提取各组MDA-MB-231细胞总RNA后置于-80℃超低温冰箱内保存。RNA 2 μL，10×RT Buffer 2 μL，dNTP 0.4 μL，Multiscripe RT 1 μL，10×Random Primer 2 μL，RNase-Free ddH2O 补足体系至 20 μL；反应条件：25 ℃ 10 min，37 ℃ 60 min，95 ℃ 5 min，4 ℃保存。qRT-PCR反应体系：SYBR Green Master Mix 10μL/孔，正反向引物 0.8μL/孔，cDNA1μL/孔，ddH2O补足体系至20 μL；反应程序：95℃预变性5 min循环1次，95℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共循环 40 次。采用 2-ΔΔCt法计算 circOSBPL10、miR-128-3p相对表达量。

1.2.7 双荧光素酶报告基因检测circOSBPL10与miR-128-3p的靶向关系 StarBase预测显示circOSBPL10与miR-128-3p存在结合位点，含有结合位点的片段克隆至pmirGLO载体得到野生型载体WT-circOSBPL10，采用基因突变技术将结合位点进行突变，含有突变位点的片段克隆至pmirGLO载体得到突变型载体 MUT-circOSBPL10，miR-NC、miR-128-3p mimics分别与 WT-circOSBPL10、MUT-circOSBPL10共转染入MDA-MB-231细胞后置于培养箱内继续培养24 h，采用双荧光素酶报告基因检测系统检测各组细胞荧光素酶活性。

1.2.8 Western blot检测 Ki-67、MMP-2、MMP-9 蛋白表达 各组MDA-MB-231细胞中加入500 μL RIPA裂解液提取细胞总蛋白，采用BCA法测定蛋白浓度后加入上样缓冲液，沸水孵育10 min，蛋白变性，取50 μg蛋白进行SDS-PAGE电泳分离蛋白，将分离的蛋白凝胶转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜后室温封闭2 h（5%脱脂奶粉），加入稀释比例1∶1 000 的一抗与内参 GAPDH（1∶1 000）一抗，将其置于4℃培养箱内孵育过夜，采用TBST洗涤后加入二抗稀释液（1∶50 000），将其置于室温条件下孵育1 h，采用TBST洗涤，滴加ECL，暗室内曝光显影，应用Image J软件分析各条带灰度值（蛋白相对表达量=目的蛋白条带灰度值/内参照条带灰度值）。

1.3 统计学处理 采用SPSS 21．0统计学软件分析数据，计量资料均符合正态分布以均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD法，P＜0．05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 醉茄素A对乳腺癌MDA-MB-231细胞糖酵解的影响 与对照组比较，醉茄素A低剂量组、醉茄素A中剂量组、醉茄素A高剂量组葡萄糖消耗与乳酸生成量以及丙酮酸激酶、己糖激酶的水平均明显降低（P＜0．05），且醉茄素 A 低剂量组、醉茄素 A中剂量组、醉茄素A高剂量组间各指标比较差异有统计学意义（P＜0．05），见表1。

表1 醉茄素A对乳腺癌MDA-MB-231细胞糖酵解的影响（±s）Tab.1 Effect of withaferin A on glycolysis of breast cancer MDA-MB-231 cells（±s）

表1 醉茄素A对乳腺癌MDA-MB-231细胞糖酵解的影响（±s）Tab.1 Effect of withaferin A on glycolysis of breast cancer MDA-MB-231 cells（±s）

注：与对照组比较，*P＜0．05；与醉茄素 A 低剂量组比较，#P＜0．05；与醉茄素 A 中剂量组比较，△P＜0．05。

组别对照组醉茄素A低剂量组醉茄素A中剂量组醉茄素A高剂量组n 9 9 9 9葡萄糖消耗（μmol/L） 乳酸生产量（μmol/L） 丙酮酸激酶（U/mg） 己糖激酶（U/mg）33．61±3．04 46．43±3．68 0．96±0．07 8．65±0．76 25．21±2．14* 36．06±2．56* 0．75±0．06* 6．52±0．51*16．85±1．23*# 22．53±2．11*# 0．61±0．05*# 5．02±0．49*#10．01±1．03*#△ 13．81±1．26*#△ 0．44±0．04*#△ 3．54±0．41*#△

2.2 醉茄素A对乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖的影响 与对照组比较，醉茄素A低剂量组、醉茄素A中剂量组、醉茄素A高剂量组细胞增殖抑制率升高（P＜0．05），Ki-67 蛋白水平降低（P＜0．05），且醉茄素A低剂量组、醉茄素A中剂量组、醉茄素A高剂量组间细胞增殖抑制率、Ki-67蛋白水平比较差异有统计学意义（P＜0．05），见图1、表2。

图1 Ki-67蛋白表达Fig.1 Expression of Ki-67 protein

表2 醉茄素A对乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖的影响（±s）Tab.2 Effect of withaferin A on the proliferation of breast cancer MDA-MB-231 cells（±s）

表2 醉茄素A对乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖的影响（±s）Tab.2 Effect of withaferin A on the proliferation of breast cancer MDA-MB-231 cells（±s）

注：与对照组比较，*P＜0．05；与醉茄素A低剂量组比较，#P＜0．05；与醉茄素 A 中剂量组比较，△P＜0．05。

组别 n 抑制率（%） K i-6 7蛋白对照组 9 0．0 0±0．0 0 0．6 5±0．0 4醉茄素 A 低剂量组 9 2 6．5 8±2．0 8* 0．5 1±0．0 3*醉茄素 A 中剂量组 9 4 0．5 6±3．4 8*# 0．3 9±0．0 3*#醉茄素 A 高剂量组 9 6 5．7 7±4．5 7*#△ 0．2 3±0．0 2*#△

2.3 醉茄素A对乳腺癌MDA-MB-231细胞迁移、侵袭的影响 与对照组比较，醉茄素A低剂量组、醉茄素A中剂量组、醉茄素A高剂量组迁移及侵袭细胞数减少（P＜0．05），MMP-2、MMP-9 蛋白水平降低（P＜0．05），且醉茄素 A 低剂量组、醉茄素 A 中剂量组、醉茄素A高剂量组间上述指标比较差异有统计学意义（P＜0．05），见图2、表3。

图2 醉茄素A对乳腺癌MDA-MB-231细胞迁移、侵袭的影响Fig.2 Effect of withaferin A on the migration and invasion of breast cancer MDA-MB-231 cells

表3 醉茄素A对乳腺癌MDA-MB-231细胞迁移侵袭的影响（±s）Tab.3 Effect of withaferin A on the migration and invasion of breast cancer MDA-MB-231 cells（±s）

表3 醉茄素A对乳腺癌MDA-MB-231细胞迁移侵袭的影响（±s）Tab.3 Effect of withaferin A on the migration and invasion of breast cancer MDA-MB-231 cells（±s）

注：与对照组比较，*P＜0．05；与醉茄素 A 低剂量组比较，#P＜0．05；与醉茄素 A 中剂量组比较，△P＜0．05。

组别 n 迁移细胞数（个） 侵袭细胞数（个） MMP-2蛋白 MMP-9蛋白对照组 6 117．71±11．69 98．51±7．79 0．84±0．06 0．58±0．03醉茄素 A 低剂量组 6 87．71±5．43* 79．07±5．43* 0．71±0．04* 0．44±0．03*醉茄素 A 中剂量组 6 69．75±5．25*# 57．71±3．54*# 0．56±0．04*# 0．29±0．02*#醉茄素 A 高剂量组 6 48．94±4．75*#△ 37．04±3．04*#△ 0．39±0．03*#△ 0．16±0．02*#△

2.4 醉茄素A对乳腺癌MDA-MB-231细胞circOSBPL10和miR-128-3p表达的影响 与对照组比较，醉茄素A低剂量组、醉茄素A中剂量组、醉茄素A高剂量组 circOSBPL10 的表达水平降低（P＜0．05），miR-128-3p的表达水平升高（P＜0．05），且醉茄素 A 低剂量组、醉茄素A中剂量组、醉茄素A高剂量组间circOSBPL10、miR-128-3p的表达水平比较差异有统计学意义（P＜0．05），见表4。

表4 醉茄素A对乳腺癌MDA-MB-231细胞circOSBPL10和miR-128-3p表达的影响（±s）Tab.4 Effect of withaferin A on the expression of circOSBPL10 and miR-128-3p in breast cancer MDAMB-231 cells（±s）

表4 醉茄素A对乳腺癌MDA-MB-231细胞circOSBPL10和miR-128-3p表达的影响（±s）Tab.4 Effect of withaferin A on the expression of circOSBPL10 and miR-128-3p in breast cancer MDAMB-231 cells（±s）

注：与对照组比较，*P＜0．05；与醉茄素A低剂量组比较，#P＜0．05；与醉茄素 A 中剂量组比较，△P＜0．05。

组别 n circOSBPL10 miR-128-3p对照组 9 1．00±0．06 1．00±0．05醉茄素 A 低剂量组 9 0．79±0．05* 1．68±0．15*醉茄素 A 中剂量组 9 0．62±0．04*# 2．53±0．21*#醉茄素 A 高剂量组 9 0．47±0．03*#△ 3．10±0．21*#△

2.5 circOSBPL10靶向对miR-128-3p表达的影响 StarBase预测显示circOSBPL10与miR-128-3p存在结合位点，见图3。miR-128-3p过表达可明显降低野生型载体WT-circOSBPL10的荧光素酶活性（P＜0．05），而对突变型载体 MUT-circOSBPL10 的荧光素酶活性无明显影响（P＞0．05），见表5。与pcDNA组比较，pcDNA-circOSBPL10组miR-128-3p的表达水平降低（P＜0．05）；与 si-NC 组比较，si-circOSBPL10组miR-128-3p的表达水平升高（P＜0．05），见表6。

图3 circOSBPL10的序列中含有与miR-128-3p互补的核苷酸序列Fig.3 Sequence of circOSBPL10 contains a nucleotide sequence complementary to miR-128-3p

表5 双荧光素酶报告实验（±s）Tab.5Double luciferase report experiment（±s）

表5 双荧光素酶报告实验（±s）Tab.5Double luciferase report experiment（±s）

注：与 miR-NC 组比较，*P＜0．05。

组别 n WT-circOSBPL10 MUT-circOSBPL10 miR-NC 组 9 1．02±0．06 1．04±0．07 miR-128-3p 组 9 0．53±0．04* 1．01±0．06

表6 circOSBPL10调控 miR-128-3p的表达（±s）Tab.6 Expression of miR-128-3p regulated by the circOSBPL10（±s）

表6 circOSBPL10调控 miR-128-3p的表达（±s）Tab.6 Expression of miR-128-3p regulated by the circOSBPL10（±s）

注：与 pcDNA 组比较，*P＜0．05；与 si-NC 组比较，#P＜0．05。

组别 n miR-128-3p pcDNA 组 9 1．00±0．06 pcDNA-circOSBPL10 组 9 0．41±0．03*si-NC 组 9 0．98±0．06 si-circOSBPL10 9 2．76±0．22#

2.6 抑制circOSBPL10表达对乳腺癌MDA-MB-231细胞糖酵解、增殖、迁移、侵袭的影响 与si-NC组比较，si-circOSBPL10组葡萄糖消耗与乳酸产生量以及丙酮酸激酶、己糖激酶的水平均明显降低（P＜0．05），细胞增殖抑制率升高（P＜0．05），迁移及侵袭细胞数减少（P＜0．05），Ki-67、MMP-2、MMP-9 蛋白水平降低（P＜0．05），见图4、图5、表7、表8。

图4 抑制circOSBPL10表达对乳腺癌MDA-MB-231细胞迁移、侵袭的影响Fig.4 Effect of inhibiting the expression of circOSBPL10 on the migration and invasion of breast cancer MDA-MB-231 cells

图5 增殖、迁移、侵袭相关蛋白表达Fig.5 Expression of the proliferation，migration and invasion related protein

表7 抑制circOSBPL10表达对乳腺癌MDA-MB-231细胞糖酵解、增殖、迁移、侵袭的影响（±s）Tab.7 Effect of inhibiting circOSBPL10 expression on glycolysis，proliferation，migration and invasion of breast cancer MDA-MB-231 cells（±s）

表7 抑制circOSBPL10表达对乳腺癌MDA-MB-231细胞糖酵解、增殖、迁移、侵袭的影响（±s）Tab.7 Effect of inhibiting circOSBPL10 expression on glycolysis，proliferation，migration and invasion of breast cancer MDA-MB-231 cells（±s）

注：与 si-NC 组比较，*P＜0．05。

组别si-NC组si-circOSBPL10组n 9 9 circOSBPL10 miR-128-3p葡萄糖消耗（μmol/L）侵袭细胞数（个）1．00±0．05 1．00±0．06 34．63±3．16 48．34±3．52 0．99±0．08 8．87±0．79 6．04±0．51 116．92±11．08 95．72±5．34 0．31±0．03* 2．85±0．21* 13．76±1．28*19．81±1．61* 0．52±0．05* 4．45±0．47* 52．61±4．66* 56．08± 4．62*43．17±4．02*乳酸生成量（μmol/L）丙酮酸激酶（U/mg）己糖激酶（U/mg）抑制率（%）迁移细胞数（个）

表8 抑制circOSBPL10表达对乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖、迁移、侵袭相关蛋白表达的影响（±s）Tab.8 Effect of inhibiting the expression of circOSBPL10 on the expression of proliferation，migration and invasionrelated proteins in breast cancer MDA-MB-231 cells（±s）

表8 抑制circOSBPL10表达对乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖、迁移、侵袭相关蛋白表达的影响（±s）Tab.8 Effect of inhibiting the expression of circOSBPL10 on the expression of proliferation，migration and invasionrelated proteins in breast cancer MDA-MB-231 cells（±s）

注：与 si-NC 组比较，*P＜0．05。

组别 n Ki-67蛋白 MMP-2蛋白 MMP-9蛋白si-NC 组 9 0．66±0．05 0．86±0．06 0．56±0．04 si-circOSBPL10 组 9 0．29±0．02* 0．44±0．03* 0．24±0．02*

2.7 circOSBPL10过表达逆转了醉茄素A（40μg/mL）对乳腺癌MDA-MB-231细胞糖酵解、增殖、迁移和侵袭的作用 与醉茄素A+pcDNA组比较，醉茄素A+pcDNA-circOSBPL10组葡萄糖消耗与乳酸产生量以及丙酮酸激酶、己糖激酶的水平均明显升高（P＜0．05），细胞增殖抑制率降低（P＜0．05），迁移及侵袭细胞数增多（P＜0．05），Ki-67、MMP-2、MMP-9 蛋白水平升高（P＜0．05），见图6、图7、表9、表10。

图6 乳腺癌MDA-MB-231细胞的迁移和侵袭Fig.6 Migration and invasion of breast cancer MDA-MB-231 cells

图7 增殖、迁移、侵袭相关蛋白表达Fig.7 Expression of the proliferation，migration and invasion related protein

表9 circOSBPL10过表达逆转了醉茄素A对乳腺癌MDA-MB-231细胞糖酵解、增殖、迁移和侵袭的作用（±s）Tab.9 Overexpression of circOSBPL10 reversed the effects of withaferin A on glycolysis，proliferation，migration and invasion of breast cancer MDA-MB-231 cells（±s）

表9 circOSBPL10过表达逆转了醉茄素A对乳腺癌MDA-MB-231细胞糖酵解、增殖、迁移和侵袭的作用（±s）Tab.9 Overexpression of circOSBPL10 reversed the effects of withaferin A on glycolysis，proliferation，migration and invasion of breast cancer MDA-MB-231 cells（±s）

注：与醉茄素 A+pcDNA 组比较，*P＜0．05。

组别醉茄素A+pcDNA组醉茄素A+pcDNA-circOSBPL10组n 9 9 circOSBPL10 miR-128-3p 葡萄糖消耗（μmol/L）侵袭细胞数（个）1．00±0．06 1．00±0．04 10．17±0．99 12．58±1．14 0．39±0．04 3．12±0．29 67．17±4．61 46．61±4．08 36．09±3．23乳酸生成量（μmol/L）丙酮酸激酶（U/mg）己糖激酶（U/mg）抑制率（%）迁移细胞数（个）2．73±0．21* 0．41±0．03* 24．21±2．18*34．98±3．12* 0．82±0．07* 7．13±0．77* 22．52±2．09* 91．63±6．58* 80．57±6．09*

表10 circOSBPL10过表达逆转了醉茄素A对乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖、迁移和侵袭相关蛋白表达的作用（±s）Tab.10 Overexpression of circOSBPL10 reversed the effect of withaferin A on the proliferation，migration and invasion-related protein expression of breast cancer MDAMB-231 cells（±s）

表10 circOSBPL10过表达逆转了醉茄素A对乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖、迁移和侵袭相关蛋白表达的作用（±s）Tab.10 Overexpression of circOSBPL10 reversed the effect of withaferin A on the proliferation，migration and invasion-related protein expression of breast cancer MDAMB-231 cells（±s）

注：与醉茄素 A+pcDNA 组比较，*P＜0．05。

组别 n Ki-67蛋白 MMP-2蛋白 MMP-9蛋白醉茄素 A+pcDNA 组 9 0．22±0．02 0．38±0．03 0．15±0．02醉茄素A+pcDNA-circOSBPL10组9 0．57±0．03* 0．75±0．04* 0．47±0．03*

3 讨论

乳腺癌的治疗方案主要包括手术、放疗、化疗等，降低患者生活质量。随着研究的不断深入，越来越多的研究发现，植物提取物及其活性成分对抗乳腺癌具有抑制作用，例如，葛根素通过阻断核因子-κB（NF-κB）和外周信号调节激酶（Erk）途径抑制乳腺癌细胞迁移，侵袭和黏附[8]。人参皂苷Rh2通过调控LncRNA C3orf67-AS1抑制乳腺癌细胞的增殖[9]。番石榴碱通过阻断STAT3信号通路而抑制乳腺癌的生长和转移[10]。但醉茄素A治疗乳腺癌的分子机制尚未阐明。

醉茄素A对乳腺癌等肿瘤细胞具有明显抑制作用，研究表明醉茄素A可抑制非小细胞肺癌细胞增殖及促进细胞凋亡，其作用机制与抑制PI3K/Akt通路的激活有关[11]。醉茄素A可促进肝癌耐药细胞凋亡，其作用机制与抑制JAK/STAT通路的活化有关[12]。本研究结果显示，不同剂量的醉茄素A可明显降低乳腺癌细胞葡萄糖消耗与乳酸生成量，且随着药物浓度的增加而明显降低。葡萄糖消耗与乳酸生成量以及丙酮酸激酶、己糖激酶的水平是反应糖酵解水平的重要指标，而糖酵解水平升高可促进细胞增殖[13]。本研究结果提示醉茄素A可降低乳腺癌细胞糖酵解水平，且呈剂量依赖性。本研究结果显示，不同剂量的醉茄素A处理后可明显提高乳腺癌细胞增殖抑制率，并可抑制Ki-67的表达，且呈剂量依赖性。研究表明Ki-67的表达情况可作为判断肿瘤细胞增殖活性的指标，其表达量升高预示增殖能力增强[14]。提示醉茄素A可能通过降低乳腺癌细胞糖酵解水平而抑制细胞增殖。本研究结果显示，不同剂量的醉茄素A作用于乳腺癌细胞后可明显减少迁移及侵袭细胞数，还可抑制MMP-2、MMP-9的表达，且呈剂量依赖性。MMP-2、MMP-9蛋白是反映细胞转移能力的检测指标，其发挥作用与降解细胞外基质沉积有关[15]。提示醉茄素A可抑制乳腺癌细胞迁移及侵袭。然而，醉茄素A调控乳腺癌细胞生物学行为的分子机制尚未可知。

为进一步探讨醉茄素A影响乳腺癌细胞生物学行为的分子机制，本研究采用qRT-PCR检测醉茄素A处理后乳腺癌细胞中基因表达情况，结果发现circOSBPL10的表达水平降低，且随着药物剂量的增加而明显降低，提示醉茄素A可能通过抑制circOSBPL10的表达从而发挥抗乳腺癌的作用。circOSBPL10在宫颈癌细胞中呈高表达，并可通过miR-1179/UBE2Q1轴增强宫颈癌细胞的增殖和迁移能力[16]。本研究结果显示，抑制circOSBPL10表达可明显降低乳腺癌细胞葡萄糖消耗与乳酸生成量，提高细胞增殖抑制率，而减少迁移及侵袭细胞数，提示抑制circOSBPL10表达可降低乳腺癌细胞糖酵解水平而抑制细胞增殖，并可降低细胞迁移及侵袭能力。本研究进一步证实circOSBPL10可充当miR-128-3p的海绵分子，并可负向调控miR-128-3p的表达。miR-128-3p通过靶向ZEB1而抑制食管鳞状细胞癌细胞转移和上皮-间质转化[17]。LncRNA PVT1通过调节miR-128-3p/GREM1轴促进胶质瘤的发生和发展[18]。抑制LncRNA MIR4435-2HG通过调节miR-128-3p/MSI2轴而抑制宫颈癌细胞的增殖、迁移和侵袭[19]。LncRNA TUG1通过调节miR-128-3p/YES1轴而加速前列腺癌的进展[20]。本研究结果显示，醉茄素A处理的乳腺癌细胞中miR-128-3p的表达水平升高，且随着药物浓度的增加而明显升高，提示醉茄素A可能通过降低circOSBPL10的表达而上调miR-128-3p的表达，分析原因可能为circOSBPL10序列上含有miR-128-3p的结合位点，circOSBPL10可竞争性结合miR-128-3p而负向调控其表达。同时，采用醉茄素A与circOSBPL10过表达联合处理乳腺癌细胞，结果显示，葡萄糖消耗与乳酸生成量均明显升高，而细胞增殖抑制率降低，细胞迁移及侵袭能力增强，提示醉茄素A可通过下调circOSBPL10的表达而上调miR-128-3p的表达从而调控乳腺癌细胞糖酵解、增殖、迁移及侵袭。

综上所述，醉茄素A可通过调控circOSBPL10/miR-128-3p轴而降低乳腺癌细胞糖酵解水平进而抑制细胞增殖，并可抑制乳腺癌细胞迁移及侵袭，circOSBPL10/miR-128-3p轴可能作为醉茄素A治疗乳腺癌的潜在靶点。但醉茄素A如何调控circOSBPL10/miR-128-3p通路下游靶基因，及其可能作用机制尚需进一步探究，下一步实验将采用体内动物实验进一步验证circOSBPL10/miR-128-3p通路在醉茄素A抗乳腺癌中的作用机制。