黄芩苷通过Ebf3基因调控骨髓间充质干细胞成骨分化

李博乐 江长青 刘振鹏 夏冰

(1浙江中医药大学研究生院，浙江 杭州 310053；浙江骨伤医院 2创二病区；3关节病区；4浙江省人民医院骨科)

骨质疏松是一种以骨丢失和骨组织结构退化为特征的慢性骨代谢紊乱，随着老年人口的增长，骨质疏松已成为世界范围内的主要公共卫生问题〔1,2〕。由于骨质疏松是一种慢性疾病，而天然类黄酮具有副作用少且适合长期使用的优势〔3,4〕。黄酮类化合物，黄芩苷(BC)在中药配方中用于抗感染已有数千年的临床治疗历史。研究发现，BC在骨质形成、成骨分化中具有调控作用，但其作用机制仍有待继续研究〔5～8〕。本研究旨在探究BC在骨髓间充质干细胞(BMSC)增殖和成骨分化中的作用机制。

1 材料与方法

1.1材料 1代人BMSCs细胞购自Scien Cell；碱性磷酸酶(ALP)检测试剂盒购自北京绿源博德生物科技有限公司；BC(纯度≥99%)、β-甘油磷酸钠、地塞米松、二磷酸抗坏血酸均购自中国医药生物制品控制所。细胞计数试剂盒(CCK)-8购自日本同仁化学研究所；实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-qPCR)试剂盒购自日本TaKaRa；实验中所涉及的所有质粒、引物送至苏州金唯智生物公司完成。

1.2方法

1.2.1细胞处理 1代人BMSCs细胞用含20%胎牛血清的DMEM完全培养基培养，培养条件为37℃、5%CO2、饱和适度的恒温细胞培养箱中培养、传代，培养至第3代用于实验研究。

1.2.2细胞分组 成骨诱导液(100 nmol/L地塞米松、0.05 mmol/L二磷酸抗坏血酸，10 mmol/L β-甘油磷酸钠溶解于含有100 ml/L胎牛血清的DMEM培养液)处理BMSCs细胞6 d，3 d更换1次新鲜培养液，至第6天的细胞标记为BMSCs组。将BC(50、100、500 ng/ml)处理BMSCs细胞6 d，标记为50、100、500 ng/ml组。需要注意的是所有培养液中需要含有0.01%的DMSO。从中选取最适浓度的BC记为BC组(100 ng/ml)。使用脂质体将质粒或者DNA转染至BMSCs细胞(脂质体与质粒量的比例为3∶1)，具体方法为：先将脂质体和质粒或DNA混合均匀，再加入细胞共培养6 h，然后再更换新培养基继续培养48 h。结束后再用RT-qPCR检测转染的效率，确认转染成功后再用于后续实验的操作。具体转染的质粒或DNA为：pcDNA组(转染pcDNA)、pcDNA-早期B细胞因子(Ebf)3组(转染pcDNA-Ebf3)、si-NC组(转染si-NC)、si-Ebf3组(转染si-Ebf3)、BC+si-NC组(转染si-NC再用BC处理)、BC+si-Ebf3组(转染si-Ebf3再用BC处理)。

1.2.3CCK-8实验 将需要检测的细胞调整至适当浓度(105个/ml)，按照CCK-8试剂盒要求操作，加入细胞样本后，再加入CCK-8反应液，孵育后在酶标仪上测量细胞吸光度(A490)。细胞存活率(%)=(1-A490样本/A490对照)×100%。每个样本做3个平行复孔，实验重复3次。

1.2.4酶联免疫吸附试验(ELISA) 将需要检测的细胞先用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤，再按照ALP检测试剂盒要求操作，加入基质液、显色液，最后检测细胞的吸光度(A450)并进行分析。每个样本做3个平行复孔，实验重复3次。

1.2.5RT-qPCR 将需要检测的细胞收集后，用RNA抽提试剂盒提取总RNA，在将其合成cDMA，以此为模板。用RT-qPCR试剂盒进行骨钙素(Osteocalcin)、Ebf3的检测。结果用2-△△Ct法计算Osteocalcin、Ebf3的表达。引物序列为：Osteocalcin：上游引物5′-CAGCGGCCCTGATACGGAAATCG-3′，下游引物：5′-GCCGGAGTCTGTTCACTACCTTA-3′；Eb-f3：上游引物5′-CAGATATCGTGCCTCTTAGTGC-3′，下游引物:5′-TCTCAGTGCGTCCATGTGAGTC-3′；GAPDH：上游引物：5′-CACCGACACCCACTCCTC-3′，下游引物：5′-TGAGGTCCACCACCCTGT-3′。每个样本做3个平行复孔，实验重复3次。

1.2.6Western印迹 收集细胞，对细胞进行裂解并提取总蛋白。将蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，将分离的蛋白用转膜仪转移至NC膜。将膜用脱脂奶粉封闭处理2 h。在将膜用一抗(1∶1 500)孵育过夜(4℃)，第2天将膜再次用二抗(1∶2 000)孵育2 h(37℃)。结束后，将膜用电化学发光(ECL)试剂盒进行显影、曝光。每个样本做3个平行复孔，实验重复3次。

1.3统计学方法 采用SPSS22.0软件进行方差分析、SNK-q检验、t检验。

2 结 果

2.1BC对成骨诱导液诱导的BMSCs增殖、成骨分化的影响 与BMSCs组相比，100、500 ng/ml组诱导的BMSCs细胞存活率、ALP活性，Osteocalcin mRNA表达显著升高(P<0.05)。见表1。可见，BC可促进成骨诱导液诱导的BMSCs增殖和骨向分化。其中100 ng/ml BC处理的效果最佳，故选用该浓度用于后续实验。

表1 BC处理的成骨诱导液诱导的 BMSCs增殖和成骨分化

2.2BC对成骨诱导液诱导的BMSCs细胞Ebf3表达的影响 与BMSCs组相比，BC组细胞中Ebf3的mRNA和蛋白表达均显著升高(P<0.05)。见图1、表2。可见，BC可上调成骨诱导液诱导的BMSCs细胞中Ebf3表达。

图1 BC处理的BMSCs细胞Ebf3蛋白的表达

表2 BC处理后的成骨诱导液诱导的 BMSCs细胞Ebf3的表达

2.3过表达Ebf3对成骨诱导液诱导的BMSCs细胞增殖、成骨分化的影响 与pcDNA组相比，pcDNA-Ebf3组细胞中Ebf3 mRNA和蛋白表达、细胞存活率、ALP活性、Osteocalcin mRNA表达均显著升高(P<0.05)。见图2、表3。提示过表达Ebf3可促进成骨诱导液诱导的BMSCs细胞增殖和成骨分化。

图2 过表达Ebf3的BMSCs细胞Ebf3蛋白的表达

表3 过表达Ebf3的成骨诱导液诱导BMSCs细胞的增殖和成骨分化

2.4敲减Ebf3对成骨诱导液诱导的BMSCs细胞增殖、成骨分化的影响 与si-NC组相比，si-Ebf3组细胞中Ebf3 mRNA和蛋白表达、细胞存活率、ALP活性和Osteocalcin mRNA表达均显著降低(P<0.05)。见图3、表4。可见，敲减Ebf3抑制成骨诱导液诱导的BMSCs细胞增殖和成骨分化。

图3 敲减Ebf3的BMSCs细胞Ebf3蛋白的表达

表4 敲减Ebf3的成骨诱导液诱导的BMSCs细胞的增殖和成骨分化

2.5敲减Ebf3对BC处理的成骨诱导液诱导BMSCs细胞增殖、成骨分化的影响 与BC组及BC+si-NC组相比，BC+si-Ebf3组细胞中Ebf3的mRNA和蛋白表达、细胞存活率、ALP活性和Osteocalcin mRNA表达均显著降低(P<0.05)。见图4、表5。可见，下调Ebf3可明显减弱BC对成骨诱导液诱导的BMSCs细胞增殖和成骨分化作用。

图4 不同处理组的BMSCs细胞Ebf3蛋白的表达

表5 敲减Ebf3对黄芩素处理的成骨诱导液诱导的BMSCs细胞增殖、成骨分化

3 讨 论

Zhao等〔9〕研究报道，BC增强了地塞米松诱导的斑马鱼幼虫骨质疏松的生长和发育。通过钙黄绿素染色和钙磷测定表明，BC改善了地塞米松诱导的骨质疏松斑马鱼幼虫的矿化作用。BC还调节核因子κB受体活化因子配体(RANKL)和骨保护素(OPG)的表达，并阻止在DEX诱导下在斑马鱼中与骨形成和吸收相关的基因表达的变化，又通过分子对接推断出BC可直接与RANKL的胞外域相互作用，揭示了BC通过调节核因子κB受体活化因子(RANK)/RANKL/OPG信号传导通路改善了DEX诱导的骨质疏松。Zhu等〔10〕发现，BC抑制脂多糖(LPS)诱导的间充质干细胞(MSC)白细胞介素(IL)-1β、IL-8和肿瘤坏死因子(TNF)-α的表达水平，而丝裂原活化蛋白激酶(ERK)抑制剂能够恢复炎症作用，说明BC在MSC中具有促进上皮分化、细胞增殖的作用，其机制与ERK通路活性有关。研究显示BC可以通过Wnt/β-catenin信号通路增加成骨细胞矿化作用并促进成骨细胞分化〔11〕。

本研究结果说明Ebf3在BMSCs细胞的增殖和成骨分化中具有重要的促进作用，敲减Ebf3还可明显的减弱BC对成骨诱导BMSCs细胞的增殖、成骨分化促进作用。这是国内外首次发现BC通过Ebf3调控BMSCs细胞的增殖和成骨分化，为BC在骨质疏松治疗中的应用提供理论支持。Seike等〔12〕发现，Ebf3在间充质细胞中的表达异常升高，并且表达Ebf3的细胞在成年骨髓的自我更新中发挥重要作用；当MSC中Ebf3表达缺失时，造血干细胞的微环境会受到严重破坏，并且在老年小鼠中骨髓发生骨质硬化。EBF能够与非典型的锌指和螺旋-环-螺旋基序结合的高度保守DNA相结合的转录因子，其与相关的蛋白质(Ebf2、Ebf3、Ebf4、Collier/Knot和Unc-3)构成一个新的转录因子家族，称为EBF家族〔13〕。Ebf3为该家族成员之一，其参与人类神经系统疾病和多种肿瘤的发展〔14〕。