lncRNA调控间充质干细胞向成骨细胞分化的研究进展

张瑞欣，董语迪，肖建辉△

间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs），又称间充质基质细胞（mesenchymal stromal cells，MSCs），是一种多能性基质细胞，曾被命名为成骨干细胞，其在骨病损及骨再生修复方面具有广阔的应用前景［1］。在非编码RNA中，有一类由RNA聚合酶Ⅱ产生的，长度超过200 nt的长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA），被认为是基因组中的“转录噪音”。近年来发现lncRNA在参与染色质重构、DNA甲基化、组蛋白修饰及作为miRNA前体等方面发挥了极其重要的作用，并且受到越来越多的关注［2］。lncRNA在MSCs成骨分化中具有转录前、转录后和翻译后水平调节的特殊作用。同时，lncRNA对骨代谢平衡有重要调控作用，可通过多种信号通路和转录因子影响MSCs成骨分化过程。本文就lncRNA调控MSCs成骨分化的最新研究进展综述如下。

1 lncRNA激活相关信号通路调节成骨分化

1.1 MAPK信号通路 MAPK通路主要包括ERK通路、JNK通路以及p38 MAPK通路，其中p38 MAPK信号通路在调节MSCs成骨分化过程中发挥重要作用。Zhang等［3］利用成骨培养基诱导骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）成骨分化，同时分析了一种被称为分化拮抗非蛋白编 码RNA（differentiation antagonizing nonprotein coding RNA，DANCR）的lncRNA表达情况，结果显示，在成骨培养基诱导BMSCs成骨分化后，DANCR在BMSCs中的表达水平下降，提示DANCR可能是BMSCs成骨分化过程中的重要调节因子，进一步敲减DANCR后观察到成骨标志物COL1和Runx2的mRNA表达水平上调，而过表达DANCR导致磷酸化p38丝裂原活化（p-p38）蛋白表达水平下调，但ERK1/2、JNK蛋白表达水平无明显变化；为了进一步揭示诱导BMSCs成骨分化过程中p38蛋白与DANCR的关系，使用p38特异性抑制剂SB203580处理转染DANCR过表达载体（pcDNA3.1-DANCR）的BMSCs，发现过表达DANCR导致p38 MAPK信号通路失活，提示DANCR通过p38 MAPK信号通路调控BMSCs成骨分化。Zheng等［4］利用qPCR检测发现骨质疏松大鼠的BMSCs中的转移相关的肺腺癌转录本1（metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1）呈低水平表达，并证实敲减MALAT1可导致BMSCs中碱性磷酸酶（ALP）活性降低以及OCN、Runx2和COL1等成骨标志物表达水平下调，提示MALAT1可能是BMSCs成骨分化过程中的正调节因子；另外，敲减MALAT1可促进MAPK家族的ERK1/2和p38的蛋白表达水平升高，MALAT1与MAPK信号通路的关联可能为骨形成调控机制提供新的思路。有研究报道，在诱导BMSCs成骨分化过程中ALP活性增加，p-p38蛋白表达水平上调，lncRNA小核仁RNA宿主基因1（small nucleolar RNA host gene 1，SNHG1）表达水平下调，而过表达SNHG1不仅可以逆转上述作用，还能够增强神经前体细胞表达下调基因4（neural precursor cellexpressed developmentally downregulated gene 4，Nedd4）与p-p38的相互作用，破坏p-p38的蛋白稳定性，并促进p-p38泛素化；另外沉默Nedd4不仅逆转过表达SNHG1对p-p38蛋白水平的下调作用，还能增强ALP活性和提高Osterix蛋白表达水平，以上结果表明SNHG1可通过Nedd4介导p-p38泛素化负调控p38 MAPK信号通路，从而抑制BMSCs成骨分化［5］。综上，MAPK信号通路在lncRNA调控MSCs成骨分化的过程中起着重要作用。

1.2 Wnt/β-catenin信号通路 Wnt/β-catenin信号通路是经典的Wnt信号通路，在成骨细胞分化和骨形成过程中起重要作用，其中β-catenin是Wnt/β-catenin信号通路的核心，在骨骼修复的早期，β-catenin不利于骨骼修复，但在骨骼修复后期，β-catenin加快成骨细胞分化并促进其骨基质的形成，因此，在此阶段增加β-catenin含量有利于骨骼修复［6］。

Shen等［7］探讨了同源异型盒基因转录反义基因间RNA（HOX transcript antisense intergenic RNA，HOTAIR）能否通过调节Wnt/β-catenin信号通路参与BMSCs成骨分化，结果表明，敲减HOTAIR可增强ALP活性并上调成骨标志物Runx2的mRNA和蛋白表达水平，增加钙结节形成，而过表达HOTAIR不仅逆转上述作用，同时导致Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白β-catenin、cyclin D和C-myc表达水平下调，并且Wnt信号通路拮抗剂DKK1能够减弱敲减HOTAIR对BMSCs成骨分化的促进作用，表明HOTAIR抑制BMSCs成骨分化，其潜在机制可能与Wnt/β-catenin信号通路有关。由此可见，lncRNA可与Wnt/β-catenin信号通路相互作用，在MSCs成骨分化过程中起关键调节作用。

1.3 lncRNA-miRNA调控网络 自内源竞争性RNA（competing endogenous RNA,ceRNA）假说提出以来，已被多项研究证实［8-10］。lncRNA可以竞争性地与miRNA结合，参与miRNA对其靶基因的影响，从而调控MSCs成骨分化过程。

在骨形态发生蛋白2（bone morphogenetic protein 2，BMP2）诱导BMSCs成骨分化过程中，过表达lncRNA LOC100506178可上调BMSCs中的Runx2、Osterix和ALP的mRNA表达水平，有助于BMP2诱导BMSCs成骨分化，进一步研究发现过表达mir-214-5p下调BMSCs中的Runx2、Osterix和ALP的mRNA表达水平，并通过与BMP2的3'UTR结合而抑制BMP2的表达，从而抑制BMSC成骨分化；同时研究证实LOC100506178可直接调控mir-214-5p的表达水平，LOC100506178通过抑制mir-214-5p表达从而增强BMP2诱导的BMSCs成骨分化［11］。Yu等［12］在诱导肌腱干细胞（tendon stem cells，TSCs）成骨分化过程中分析了钾电压门控通道亚家族Q成员1对侧链1（potassium voltage-gated channel subfamily Q member 1 opposite strand 1，KCNQ1OT1）的表达情况，发现敲减KCNQ1OT1导致ALP活性以及Runx2和Osterix蛋白表达降低，提示KCNQ1OT1是TSCs成骨分化的正调节因子，另外通过生物信息软件发现mir-138与KCNQ1OT1之间存在可能的结合位点，并通过RNA下拉实验进一步证实了KCNQ1OT1与mir-138的相互作用关系，提示在TSCs成骨分化机制中可能涉及ceRNA机制。Shang等［13］使用糖皮质激素干预大鼠BMSCs 7 d后进行了lncRNA芯片分析，发现lncRNA TCONS_00041960表达水平下调，而过表达TCONS_00041960能够上调Runx2和Osterix的mRNA和蛋白表达，提示TCONS_00041960有助于促进BMSCs成骨分化，进一步研究发现TCONS_00041960作为内源竞争性RNA可通过抑制mir-204-5p和mir-125a-3p表达，从而增强BMSCs中Runx2的表达，促进BMSCs成骨分化。Jia等［14］在诱导BMSCs成骨分化研究中，应用高通量RNA测序技术分析筛选出6个明显上调的lncRNA，即lnc-1369、lnc-554、lnc-1269、lnc-1370、RP11-348J24.8和LINC00707，并发现过表达lncRNA LINC00707可促进BMSCs中Runx2和OCN的mRNA表达水平上调，增强ALP活性以及增加钙结节形成，表明LINC00707促进BMSCs成骨分化，进一步研究发现LINC00707充当mir-370-3p的内源竞争性RNA，LINC00707通过抑制mir-370-3p表达以增强Runx2和OCN表达水平，从而促进BMSCs的成骨分化。牙周炎是一种发生在牙周组织的慢性感染性口腔疾病，牙槽骨吸收是其导致牙齿脱落的主要原因。Feng等［15］研究发现，在成骨培养基诱导牙周间充质干细胞（periodontal mesenchymal stem cells，PDLSCs）成骨分化过程中，ALP、Runx2和OCN的蛋白表达水平以及X失活特异转录本（X inactivate-specific transcript，XIST）表达上调，而mir-214-3p表达下调，进一步研究发现敲减XIST导致Runx2和OCN蛋白表达水平下调，表明XIST促进PDLSCs成骨分化，而过表达mir-214-3p显著降低ALP、Runx2和OCN的蛋白表达水平，mir-214-3p不利于PDLSCs成骨分化；通过进一步研究发现，mir-214-3p是XIST的潜在靶标，XIST通过抑制mir-214-3p表达，增强ALP、Runx2和OCN的蛋白表达水平，从而促进PDLSCs成骨分化。基于以上lncRNA与miRNA相互作用调控PDLSCs成骨分化的结果，可以考虑将lncRNAmiRNA调控网络联合MSCs的机制应用于诱导牙槽骨再生、修复受损的牙周组织，探索新的治疗方法。由此可见，lncRNA-miRNA相互作用关系在MSCs诱导成骨分化过程中起到重要的调节作用，同时对成骨相关疾病的临床诊疗具有重要意义。

2 lncRNA介导相关转录因子调节MSCs成骨分化

2.1 CXC趋化因子配体13（CXC chemokine ligand 13，CXCL13）CXCL13已被证明能影响骨关节炎患者的成骨细胞增殖［16］。同时，趋化因子受体与配体相互作用可影响MSCs的迁移，如CXCL13可与CXC趋化因子受体5（CXC chemokine receptor 5，CXCR5）特异结合，调节MSCs的迁移和分化，并且CXCL13参与MSCs成骨分化，通过下调mir-23a而促进Runx2的表达，促进BMSCs成骨分化［16-18］。

研究发现高糖（high glucose，HG）可通过降低分离培养自4～5周龄雌性C57BL/6小鼠BMSCs中ALP活性以及Runx2、OCN和OPN的蛋白表达水平从而抑制BMSCs成骨分化，并呈时间依赖性降低AK028326和CXCL13的mRNA表达水平，而过表达AK028326能够逆转HG对BMSCs成骨分化的抑制作用，过表达CXCL 13能够增强BMSCs的ALP活性；另外，在成骨细胞系MC3T3-E1细胞中，AK028326正向调节CXCL13表达，AK028326可通过上调CXCL13的表达促进BMSCs成骨分化过程［19］。因此，CXCL 13与lncRNA相互作用有助于调节BMSCs成骨分化过程，关注两者相互作用可为骨形成调控机制以及治疗骨相关疾病（如骨质疏松症）提供新的思路。

2.2Zeste增强子同源复合物2（enhancer of Zeste homolog 2，EZH2）EZH2、Zeste基因抑制子基因12（suppressor of Zeste 12，SUZ12）和胚胎外胚层发育（embryonic ectoderm development，EED）3个核心亚基属于多梳抑制复合物2（polycomb repressive complexes 2，PRC2）。有研究发现，EZH2是MSCs成骨分化的抑制调节因子，通过敲减EZH2可上调Runx2、OPN和OCN表达水平，促进MSCs成骨分化［20］。同时，ZBTB16（zinc finger and BTB domain containing 16）、抗 黏 液 病 毒 蛋 白（myxovirus resistance，MX1）和细胞骨架相关蛋白four and half LIM domain 1（FHL1）作为EZH2的新靶点，在调节MSCs成骨分化过程中也发挥重要作用［21］。

Zhu等［22］探讨了lncRNA HoxA-AS3与EZH2相互作用对MSCs成骨分化的影响，发现敲减lncRNA HoxA-AS3可增强MSCs中ALP活性并上调成骨标志物Runx2、COL1A1、IBSP、BGLAP和SPP1的mRNA表达水平，进一步研究发现HoxA-AS3与EZH2相互作用可抑制关键成骨标志物Runx2的表达，从而抑制MSCs成骨分化。目前研究发现与EZH2相关的lncRNA包括KCNQ1OT1、GAS5、MEG3、HOTAIR和MALAT1［23］，但它们在调控MSCs成骨分化中的作用机制尚不明确。因此EZH2与lncRNA参与调控MSCs成骨分化的机制有待于深入研究。

2.3 核因子（NF）-κB NF-κB是一种可调控的转录因子，在免疫反应、炎症反应和细胞分化中起核心作用［24］。NF-κB作为炎症和宿主免疫反应的主要调节因子，在调节MSCs成骨细胞的分化以及骨骼形成方面同样发挥着重要作用［25-26］。

Jin等［27］为了证实炎症因子对人脂肪源性干细胞（human adipose-derived stem cells,hASCs）成骨分化的影响，在成骨培养基中添加外源性肿瘤坏死因子（TNF）-α/白细胞介素（IL）-17，结果发现，MIR31宿主基因（MIR31HG，也称为LOC554202）的表达水平上调，并且ALP、Osterix和Runx2的mRNA表达水平以及p65磷酸化和总β-catenin蛋白表达水平降低，为了证实TNF-α/IL-17是否通过NF-κB和β-catenin途径抑制hASCs成骨分化，分别使用BAY11-7082阻断NF-κB的活化、氯化锂（LiCl）阻断β-catenin的降解，结果发现BAY11-7082和LiCl改善了TNF-α/IL-17对hASCs成骨分化的抑制作用，表明TNF-α/IL-17通过激活NF-κB和β-catenin途径抑制hASCs成骨分化，进一步研究发现，敲减MIR31HG不仅逆转TNF-α/IL-17对hASCs成骨分化的抑制作用，还导致NF-κB的靶基因IL-6、IL-7、IL-11和TNF-α表达下调以及NF-κB活性降低，另外激活的NF-κB可促进MIR31HG的表达上调，导致ALP、Runx2、Osterix和OCN的表达下调，从而抑制hASCs成骨分化，表明MIR31HG与NF-κB相互作用可调节骨形成。Zhang等［28］利用成骨培养基诱导经血间充质干细胞（menstrual blood-derived mesenchymal stem cells，MenSCs）和脐带间充质干细胞（umbilical cord mesenchymal stem cells，UCMSCs）成骨分化，发现在MenSCs和UCMSCs中lncRNA NKILA表达水平上调，并且敲减NKILA导致MenSCs的钙结节形成减少，ALP活性降低以及Runx2、Osterix和分泌型磷酸蛋白1（secerted phosphoprotein1，SPP1）的mRNA表达水平下调，表明NKILA正向调节MenSCs成骨分化，另外通过蛋白质印迹分析和芯片证实NKILA可抑制NF-κB的转录活性，进一步研究发现NF-κB抑制剂Bay11-7082处理MenSCs导致Runx2的表达上调，提示NKILA通过NF-κB介导Runx2表达，从而促进MenSCs成骨分化。由此可见，NF-κB可参与调控MSCs成骨分化，但目前NF-κB与lncRNA调节MSCs成骨分化的机制尚未明确，有待进一步研究。

2.4 BMP BMP属于转化生长因子-β（TGF-β）超家族成员，是体内外骨形成的多能性调节因子［29］，其中BMP2、BMP4和BMP9在MSCs成骨分化过程中均发挥重要作用。

Zhang等［30］发现在诱导BMSCs成骨分化过程中mir-140-5p表达呈时间依赖性下调，而lncRNA MSC反义RNA 1（MSC antisense RNA 1，MSC-AS1）和BMP2表达以及成骨标志物Runx2、OPN、OCN的mRNA表达水平呈时间依赖性上调，提示MSC-AS1可能对BMSCs成骨分化具有调节作用，进一步研究发现敲减MSC-AS1导致Runx2、OPN和OCN的mRNA表达水平下调，表明MSC-AS1促进BMSCs成骨分化，此外，MSC-AS1作为mir-140-5p的内源竞争性RNA，通过mir-140-5p调节BMP2/Smad信号通路从而促进BMSCs成骨分化。Gan等［31］利用BMP2诱导BMSCs成骨分化，发现mir-19b-3p表达上调和lncRNA H19表达下调，并且抑制mir-19b-3p导致BMSCs的细胞增殖水平和ALP活性降低，Runx2和COL1A1蛋白表达水平下调，表明mir-19b-3p是BMSCs成骨分化的正调节因子，进一步研究发现过表达H19导致mir-19b-3p表达水平下调，以及ALP活性降低和Runx2、COL1A1的蛋白表达水平下调，提示H19通过调节mir-19b-3p从而参与BMP2诱导的BMSCs成骨分化过程。目前，BMP2已经应用于骨病的临床治疗，美国食品和药物管理局（FDA）批准在脊柱融合手术、胫骨干修复和上颌窦重建手术中可使用重组人BMP-2（rhBMP-2）［32］。BMP2和BMP4在MSCs成骨分化中均表现出成骨活性，并且BMP4作为骨形成的调节剂，在MSCs成骨分化中发挥作用。Zhuang等［33］在多发性骨髓瘤（multiple myeloma,MM）患者中分析了成骨培养基诱导MSCs成骨分化过程中lncRNA MEG3和BMP4表达情况发现，MM患者与正常供者相比，MM-MSCs中的MEG3和BMP4表达水平下降，并且MM-MSCs和正常供者MSCs中的BMP4与MEG3表达呈正相关，在BMP4诱导的MM-MSCs成骨分化过程中，MM-MSCs中Runx2、Osterix和OCN的mRNA表达水平上调，过表达MEG3影响BMP4启动子上转录因子SOX2活性从而上调BMP4的转录水平，并上调Runx2、Osterix和OCN的mRNA表达，认为MEG3与BMP4相互作用能够增强MM-MSCs的成骨分化。另外，除BMP2和BMP4外，BMP9也被认为是诱导MSCs成骨分化的有效因子之一。Zhang等［34］发现在BMP9诱导小鼠脂肪来源MSCs成骨分化早期lncRNA Rmst表达上调，并发现敲减Rmst导致BMP9诱导的小鼠脂肪来源MSCs的OPN、OCN和COL 1A1的mRNA表达显著降低，ALP活性降低，体内骨形成数量减少，提示Rmst在BMP9诱导的小鼠脂肪来源MSCs成骨分化中起促进作用。

综上所述，lncRNA通过相关信号分子调控包括BMSCs在内多种来源MSCs成骨分化，见表1。涉及诸多信号通路和转录因子，lncRNA在MSCs成骨分化中扮演着重要的角色。目前，lncRNA在MSCs成骨分化中作用的研究仍处于起步阶段，对于lncRNA调节成骨分化的功能、生物学特性以及与信号通路的相互作用关系有待深入研究。例如：（1）环状RNA（circRNA）和lncRNA相互作用可以促进干细胞的自我更新，而circRNA-lncRNA途径参与调节MSCs成骨分化过程有待进一步探究。（2）目前还存在许多未知的靶点使各调节通路相互结合从而参与调控MSCs成骨分化过程。（3）随着对lncRNA与MSCs关系研究的深入，lncRNA可否作为标志物为疾病的诊断提供依据尚未得到明确的证实。今后希望借助更多更有效的研究手段和新方法，充分揭示lncRNA调控MSCs成骨分化的作用靶点及机制，为骨质疏松症等疾病的诊治提供新思路、新策略。