农杆菌转化法中的“Ti质粒转化载体系统”的简介——一道江苏高考题的奥秘解读和拓展

黄建华

（南通大学附属中学 江苏南通 226019）

1 试题深藏奥秘

2009年江苏高考卷的34题以农杆菌转化法培育转毒素蛋白基因的植物为背景，考查基因工程的相关知识，其基本过程如图1所示。

图1 农杆菌转化法培育转Bt毒素蛋白基因的植物

图1过程采用转移法，将重组质粒转入农杆菌，再与Ti质粒重组为共整合载体，然后转化植物细胞。共整合载体是农杆菌转化法中Ti质粒转化载体系统中的一种。这与高中教材介绍的农杆菌转化法不一样，人教版高中教材介绍的农杆菌转化法是将目的基因插入到农杆菌Ti质粒的T－DNA中构成重组质粒，再将重组质粒导入农杆菌，通过农杆菌的转化作用，将目的基因插入到植物细胞染色体DNA中，其过程如图2所示。

图2 人教版教材中所示的农杆菌转化法

高中教材介绍的仅是农杆菌转化法的思路，并不是具体操作步骤，而试题将教材中的转化思路具体为转化步骤，揭秘了质粒载体系统的构建、结合转移法转移质粒等，以期让教师和学生通晓真实的操作过程，拓宽认知的视野。

2 构建Ti质粒转化载体系统的原由

2.1 农杆菌Ti质粒的结构特点决定不能用单一载体运载目的基因转化植物细胞

农杆菌Ti质粒中有T-DNA（包含生长素基因、细胞分裂素基因、冠瘿碱合成基因）、冠瘿碱代谢基因、复制起始位点、基因，其结构如图3所示。

图3 农杆菌Ti质粒结构示意图

T-DNA的转移功能与其两端25 bp的末端重复顺序有关，特别是右边界序列。农杆菌把T-DNA整合到植物细胞核DNA上后，生长素基因和细胞分裂素基因的表达使植物细胞过度分裂、生长转化为肿瘤；冠瘿碱合成基因的表达使瘤细胞合成大量冠瘿碱，供农杆菌代谢利用，加速农杆菌的繁殖，这是农杆菌为自己巧妙设计的内共生体系。但在培育转基因植物时，导入外源生长素基因、细胞分裂素基因会打破内源激素的平衡，阻碍受体植物细胞的脱分化和再分化；导入冠瘿碱合成基因、冠瘿碱代谢基因会消耗植物细胞的谷氨酸和精氨酸，影响植物细胞的生长。所以设计农杆菌Ti质粒运载目的基因时，应将这些基因去除。农杆菌Ti质粒上没有大肠杆菌的复制起点和选择标记基因，目的基因不能在大肠杆菌中保存和复制。并且，农杆菌Ti质粒上一种限制性内切酶的酶切位点有多个，很难找到单一的酶切位点用于插入目的基因。这些因素都决定了Ti质粒不能直接作为运载目的基因的载体，必须要对Ti质粒进行改造，添加大肠杆菌的复制起点、选择标记基因、多克隆位点后才能作为转基因植物的载体。T-DNA的转移需要基因表达产生的12种蛋白激活、协助，如构建单一载体运载目的基因转化植物细胞。而基因高达40 kb，会增加载体的体积，降低导入农杆菌成功率。所以，农杆菌转化法中不采用单一载体运载目的基因转化植物细胞。

2.2 农杆菌转化植物细胞的机制为构建Ti质粒转化载体系统提供了理论基础

农杆菌转化植物细胞的机制是：植物细胞分泌乙酰丁香酮（或羟基乙酰丁香酮）诱导Ti质粒上的基因以及农杆菌染色体上的基因等10个基因的表达。这些基因的表达产物共同作用将T-DNA整合到植物细胞染色体DNA中。从农杆菌转化植物细胞的机制分析，基因的表达产物是成功转化的必备条件，基因是否与T-DNA在同一质粒上不是必备条件。所以，可在体外构建携带目的基因、不携带基因的中间载体，农杆菌细胞内的质粒保留基因、去除非必须基因，然后将中间载体转入农杆菌实现转化。这为构建质粒转化载体系统提供了理论基础。

2.3 大肠杆菌与农杆菌接合高效转移质粒的特征为中间载体导入农杆菌供了方便

有的大肠杆菌细胞中含有转移协助质粒，含有转移协助质粒的大肠杆菌与农杆菌接合，能将质粒高效的转移入到农杆菌中。若大肠杆菌中同时含有中间载体和转移协助质粒则采用接合转移法转移中间载体，即把大肠杆菌和农杆菌一起培养，大肠杆菌通过与农杆菌的直接接合将中间载体转入农杆菌中（转移协助质粒也一起转入农杆菌中）。若大肠杆菌中有中间载体、没有转移协助质粒，则采用三亲杂交转移法，即把含有中间载体的大肠杆菌、含有转移协助质粒的大肠杆菌、农杆菌混合培养，通过杂交使转移协助质粒先转移到含有中间载体的大肠杆菌中，然后通过与农杆菌结合将中间载体转入到农杆菌中。这样就简化从大肠杆菌中提取质粒导入农杆菌的步骤了，现常用的方法是三亲杂交转移法。

3 Ti质粒转化载体系统的类型

由两种或两种以上的质粒构成的复合型载体称为载体系统，农杆菌转化法主要有两种载体系统：一元载体系统和双元载体系统。

3.1 一元载体系统

这类载体是中间载体与农杆菌内改造的Ti质粒通过同源重组形成一种复合型载体。农杆菌内改造后的Ti质粒也称为受体Ti质粒。根据同源重组序列的不同可分为共整合载体和拼接末端载体（也称TDNA边界拼接载体）。

3.1.1 共整合载体

共整合载体系统中的中间载体由E.Coli质粒改造而来，其中含有大肠杆菌的复制原点、细菌的选择基因、植物选择标记基因、目的基因、pBR322序列；受体Ti质粒含有农杆菌的复制原点、基因、T-DNA的左右边界、pBR322序列（位于T-DNA的左右边界之间）。当中间质粒导入含受体Ti质粒的农杆菌后，中间质粒和受体Ti质粒通过pBR322序列进行同源重组，中间载体整合到受体Ti质粒的T-DNA中形成共整合质粒（图4）。中间载体不能在农杆菌中复制，不能稳定遗传而消失。共整合质粒既能在农杆菌中复制，又带有细菌选择基因，所以含有共整合质粒的农杆菌能在选择培养基中生长，可以被筛选出来。含共整合质粒的农杆菌细胞中含有T-DNA（目的基因）、基因和基因，所以这样的农杆菌可用于植物的转化。

图4 形成共整合质粒的过程示意图

3.1.2 拼接末端载体（T-DNA边界拼接载体）

拼接末端载体的中间载体含有大肠杆菌的复制原点、细菌和选择基因、T-DNA的右边界、植物选择标记基因、目的基因、T-DNA的左边界内部序列；受体Ti质粒含有农杆菌的复制原点、基因、T-DNA的左边界内部序列、T-DNA的左边界。当中间质粒导入含受体Ti质粒的农杆菌后，中间质粒和受体Ti质粒通过T-DNA的左边界内部序列同源重组，形成拼接末端载体（图5）。含拼接末端载体的农杆菌含有选择基因、T-DNA（目的基因）、基因和基因，能在选择培养基中生长，可用于植物的转化。

图5 拼接末端载体的形成示意图

共整合载体和拼接末端载体系统的中间载体、受体Ti质粒、同源序列不同。共整合载体转化的植物中带有重复的pBR322序列，这可能会影响转化植物中目的基因的稳定性，而拼接末端载体不存在这种可能性，所以拼接末端载体的转化更有效。

3.2 双元载体系统

双元载体系统由两个分别含T-DNA和基因的Ti质粒构成，含T-DNA的Ti质粒称为微型Ti质粒。微型Ti质粒含大肠杆菌的复制原点、农杆菌的复制原点，细菌选择基因、完整的T-DNA（带有目的基因和植物选择标记基因），含基因的Ti质粒为协助Ti质粒，如图6所示。

图6 双元载体系统示意图

最常用的含协助Ti质粒的农杆菌是农杆菌LBA4404，导入微型Ti质粒的农杆菌LBA4404就具有了转化植物的能力。双元载体系统中的2个质粒不含同源序列，分子量较小，体外易操作，不需要进行同源重组，T-DNA较小，转化效率较高，但双元载体构建成功后，工程菌的稳定性较差，容易丢失。