外周血单个核细胞miR-132对老年急性髓系白血病预后的预测价值

张荣耀 李娜 李慧 张露璐 万楚成 (十堰市太和医院血液内科，湖北 十堰 442600)

急性髓系白血病(AML)是一种造血系统的恶性克隆性疾病，患者主要特征为骨髓原始细胞异常积累及正常血细胞生成障碍〔1〕。AML主要高发于60岁以上老年人群，近些年来虽然随着治疗技术的不断进步，临床疗效得到了显著提高，但由于老年患者器官代谢功能的下降及伴随的基础疾病较多等因素，老年AML患者的总体治疗预后仍然较差〔2，3〕。微小RNA(miRNA)作为一种广泛存在于机体内的短链非编码RNA，miRNA在细胞生长、器官病变及免疫反应等多种生物学过程中均发挥重要作用，同时多项研究显示，miRNA的异常表达与癌症(包括AML)的发生发展具有密切关系〔4，5〕。miR-132作为miRNA重要的成员，学者发现AML患者可出现miR-132异常表达，且miR-132具有诊断AML的能力〔6〕。然而，miR-132表达是否可预测老年AML患者治疗预后目前尚无相关研究报道。本研究拟分析外周血单个核细胞miR-132对老年AML预后的预测价值。

1 资料与方法

1.1临床资料 选择2014年3月至2018年4月十堰市太和医院收治的老年AML患者83例，其中男51例，女32例，年龄60～79岁，平均(67.28±5.42)岁。此外，选择同期在十堰市太和医院行骨髓标本检验的非白血病老年人50例为对照组，其中男29例，女21例，年龄60～76岁，平均(67.07±6.12)岁。两组性别、年龄差异无统计学意义(P>0.05)。纳入标准：①参照世界卫生组织造血和淋巴组织肿瘤分类标准(2008年版)相关诊断标准〔7〕，确诊为初发AML患者；②未接受任何治疗，包括放疗、化疗、靶向治疗或内分泌治疗；③患者无血液系统疾病史；④患者自愿签署知情同意书。排除标准：①AML复治者；②明确有中枢神经系统侵犯者；③急性早幼粒细胞白血病者；④心、肝、肾等机体主要器官功能障碍者；⑤合并严重感染、恶性肿瘤或自身免疫系统疾病史。研究经医院伦理委员会批准。

1.2治疗方案 患者采取地西他滨+高山尖杉酯碱+阿糖胞苷化疗方案。

1.3外周血单个核细胞miR-132检测 抽取两组外周静脉血4 ml(AML患者于治疗前检测)，置于乙二胺四乙酸二钾抗凝管内，使用密度梯度法分离外周血单个核细胞。在全血中加入等体积生理盐水稀释，然后缓慢加入淋巴细胞分离液，2 261 r/min离心20 min，取中间的白色环状层，加入生理盐水缓和均匀，4 378 r/min离心10 min，弃去上清后留取细胞备用。加入细胞裂解液，使用Trizol试剂提取单个核细胞中总RNA，并检测总RNA纯度。取1 μg总RNA使用逆转录试剂盒将其逆转录为cDNA，采用荧光定量聚合酶链反应(PCR)进行扩增。引物序列由上海生工生物工程有限公司合成，使用U6作为内参基因，miR-132上游引物：5′-GCCCGTAACAGTCTACAGCCAT-3′，下游引物：5′-GCAGGGTCCGAGGTATTC-3′；U6上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。PCR反应条件：95℃ 1 min，94℃ 30 s、56℃ 30 s、74℃ 30 s，共进行40个循环，每个样品设置3个复孔。使用2-△△Ct法计算外周血单个核细胞miR-132相对表达量。

1.4资料收集 收集并记录AML患者临床资料，包括性别、年龄、白细胞(WBC)计数、血红蛋白(Hb)浓度、血小板(PLT)计数、细胞遗传学、首次治疗缓解情况。

1.5随访 采取门诊来院随访、电话随访等多种形式，随访截止日期为2020年4月1日，计算患者总体生存时间(OS)：从治疗开始到末次随访或死亡的时间。

1.6统计学分析 采用SPSS22.0统计学软件进行t检验、χ2检验及Logistic回归分析，生存情况绘制Kaplan-Meier生存曲线，组间生存情况比较采用Log-rank检验，采用受试者工作特征(ROC)曲线分析miR-132对患者预后的预测价值。

2 结 果

2.1两组外周血单个核细胞miR-132相对表达量比较 AML组外周血单个核细胞miR-132相对表达量(1.974±0.372)显著高于对照组(1.263±0.215；P<0.05)。

2.2影响患者预后的单因素分析 年龄、染色体核型、首次治疗情况及外周血单个核细胞miR-132相对表达量与患者OS有关(P<0.05)，见表1。

2.3影响患者预后的多因素Logistic回归分析 对上述单因素分析具有统计学意义的各因素进行多因素Logistic回归分析，结果显示，染色体核型、外周血单个核细胞miR-132相对表达量及首次治疗情况进行回归模型(P<0.05)，为影响患者预后的独立危险因素，见表2。

表1 影响患者预后的单因素分析(个月)

表2 预后的多元Logistic回归分析

2.4不同miR-132表达患者生存情况比较 miR-132低表达(<1.974)患者生存情况显著优于miR-132高表达患者(≥1.974，P<0.05)。见图1。

2.5不同预后患者外周血单个核细胞miR-132相对表达量 根据患者随访情况，将随访OS超过12个月作为预后良好组，OS不足12个月作为预后不良组，其中预后良好组miR-132相对表达量(1.872±0.225)显著低于预后不良组(2.176±0.281；P<0.05)。

2.6miR-132对患者预后预测价值 采用ROC曲线预测患者预后，结果显示，曲线下面积为0.875，95%CI0.757～0.922，灵敏性90.36%，特异性85.54%，最佳截断值为2.216，见图2。

图1 miR-132不同表达患者的生存情况

图2 miR-132在患者中的预后价值

3 讨 论

AML是成年人最为常见的急性白血病类型，约占成年人急性白血病的80%〔8〕。有研究报道显示，AML患者5年生存率仅为30%～40%，且老年AML患者生存率更低，仅20%左右，主要由于老年患者合并疾病较多，其对化疗耐受性较差，因此老年AML患者相关的早期死亡率较高〔3，9〕。AML是骨髓造血系统的恶性肿瘤性疾病，具有高度的异质性，患者预后差别较大，寻找有效的指标对患者临床预后进行有效预测，对于治疗方案的及时调整及患者预后的改善具有重要作用〔10，11〕。miRNA作为广泛存在并参与机体多种生理功能的高度保守锻炼RNA，可在机体中稳定存在，而当机体受到内环境、外环境影响或在多种疾病发生发展过程中，miRNA可出现异常表达，成为多种疾病早期诊断及预后评估的重要参考指标，而关于miRNA对AML患者预后的预测价值，目前相关研究较为鲜见〔12，13〕。

miR-132定位于人染色体17p13.3基因间区，miR-132具有高度保守序列，研究显示〔14，15〕，miR-132与多种恶性肿瘤的发生发展密切相关。本研究结果与相关研究报道结果相似〔16，17〕，提示miR-132在AML疾病发生过程中发挥一定的调控作用。

本研究结果提示了除常规认为的染色体核型及首次治疗是否获得完全缓解以外，外周血单个核细胞miR-132相对表达量同样是影响患者总体生存情况的独立危险因素。与相关研究报道结果相似〔18，19〕，miRNA可能是AML发生发展的调控因素之一，可成为AML临床诊断治疗及预后预测的潜在指标。此外，本研究结果提示，miR-132可能调控AML疾病的发生发展，且可能通过相应的基因调控机制与多药耐药、高危细胞遗传学等多种因素相关，但具体的研究机制还需要深入研究分析。

但由于本研究纳入样本量较小，且针对miR-132对AML相关调控机制进行深入研究分析，提示进一步研究还需扩大样本量并进行相应的调控机制分析，以获得更为可靠的研究数据，供临床参考运用。

综上，老年AML患者外周血单个核细胞miR-132表达异常升高，且miR-132表达与患者预后密切相关，可作为患者预后预测的潜在生物学指标之一。