基于网络药理学探讨加味二陈汤治疗多囊卵巢综合征作用机制*

龚文婧，邵超，黄胜男

中国中医科学院广安门医院，北京 100000

多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)为临床常见的妇科内分泌性疾病，是育龄期妇女的多发疾病，主要临床表现为胰岛素抵抗、高雄激素血症、排卵障碍、卵巢多囊样、不孕、多毛、肥胖等，但其发病机制和原因尚不明确，可能涉及遗传、环境和心理因素等多方面原因。目前，临床多采用个体化对症治疗，虽能暂时取得临床疗效，但是不良反应多、药效短、靶点单一。中医药治疗PCOS存在药物多靶点治疗、系统性治疗、药效持续时间长等优势。PCOS属中医学“闭经”“癥瘕”“不孕症”等范畴，病机为脏腑功能失调，痰瘀阻滞，虚实夹杂，常见证型为肾虚肝郁证、肾虚痰湿证、肾虚痰瘀证等，临证时多从肝、脾、肾论治，应注重补肾、活血、化痰燥湿，使气血和调、胞宫按时盈满[1]。加味二陈汤是笔者在二陈汤的基础加入天南星、白术、枳实、泽兰、菟丝子等药物的自拟方剂，具有健脾燥湿化痰的作用。现代研究表明，二陈汤可以改善胰岛素抵抗、卵巢形态、调节性激素水平[2]，其中菟丝子可促进卵巢和子宫发育，具有雌激素样作用[3]。网络药理学基于药物化学成分、靶点蛋白结构与疾病通路之间的相互作用，从多系统、多靶点出发，这与中医学整体观理论有异曲同工之处，为研究中药复杂成分的作用机制提供了新思路。本文基于网络药理学方法分析加味二陈汤治疗PCOS的潜在作用靶点和信号通路，以期为临床应用提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 筛查加味二陈汤的活性成分将半夏、枳实、茯苓、菟丝子、天南星、泽兰、陈皮、白术等8味中药名称输入在中药系统药理学数据库和分析平台(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)平台[4](http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)，设置口服生物利用度(oral bioavailability，OB)为≥30%，类药性(drug likeness，DL)≥0.18，据此对每一味中药的活性成分进行筛查，得到此复方的主要活性成分。

1.2 预测加味二陈汤作用靶点通过TCMSP平台收集主要活性成分的蛋白质靶点，为了数据处理的便捷性和标准性，通过Uniprot 数据库[5](https：//www.uniprot.org/)将加味二陈汤的主要活性成分对应的蛋白质靶点规范为基因靶标。

1.3 构建中药-活性成分-基因靶点网络将中药主要活性成分、中药名和相应的基因靶标分别导入Excel再导入Cytoscape3.7.1软件，最终，借此突出其有效核心成分，并观察其相互作用机制。

1.4 筛查PCOS疾病靶点以多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)为检索词，在基因名片数据库(GeneCards，https：//www.genecards.org)、在线人类孟德尔遗传数据库(online mendelian inheritance in man，OMIM，http：//www.omim.org)、药物数据库(Drugbank，https：//www.drugbank.ca)数据库[6-7]和疾病相关基因与突变位点数据库(Disgenet，https：//www.disgenet.org)筛查PCOS疾病基因靶点数据库[7]，因这些数据库收录的疾病相关数据来源广泛，故对检索到的基因靶点进行汇集、合并等处理，获得PCOS最终的疾病靶点。

1.5 绘制加味二陈汤与PCOS共同靶点韦恩图及建立蛋白互作网络(protein protein interaction，PPI)模型将加味二陈汤药物基因靶点与PCOS疾病基因靶点间同时导入线上生信作图平台(http：//www.bioinformatics.com.cn/)绘制韦恩图。在EXCEL中提取共同基因靶点并将此导入STRING11.0数据库[8](https：//string-db.org)构建PPI模型：选择“Homo sapiens”，最小互作阈值>0.4，隐藏游离基因靶标，得到PPI模型。将PPI模型导入CytoScape3.7.1软件，Tools工具作网络拓扑属性分析，设置卡值为“节点连接度(degree) ”的2倍中位数，进一步明确提取核心基因靶标。

1.6 共有靶点富集分析用DAVID数据库[9-10](https：//david.ncifcrf.gov)对PCOS与加味二陈汤共同靶标进行基因本体(gene ontology，GO)生物功能富集分析和京都基因与基因组百科全书(kyoto encyclopodia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析，根据富集基因数选出前20个共有靶点，在Omicshare平台(http：//www.omicshare.com/tools)作可视化图。

2 结果

2.1 加味二陈汤活性成分筛选通过TCMSP数据库检索加味二陈汤的各个药物活性成分，满足OB≥30%及DL≥0.18的活性成分共有82个，其中半夏有效成分13个、茯苓有效成分15个、枳实有效成分22个、陈皮有效成分5个、天南星有效成分7个、白术有效成分7个、泽兰有效成分2个、菟丝子有效成分11个，去除重复的有效成分后剩余有效活性成分72个，潜在活性成分信息及对应蛋白靶点个数见表1。

表1 加味二陈汤潜在活性成分及对应蛋白靶点数

续表1 加味二陈汤潜在活性成分及对应蛋白靶点数

2.2 加味二陈汤活性成分的作用靶点通过Uniprot数据库将蛋白质靶点规范化为基因靶点，共获得935个作用靶点，删除重复值后，最终确定257个作用靶点，见表2。

表2 加味二陈汤活性成分的作用靶点

2.3 中药-活性成分-基因靶点网络将无相应基因靶标的活性成分排除后，把TCMSP数据库中收集到的中药主要活性成分及规范化基因靶点导入Excel表，再在 Cytoscape 3.7.1创建中药-活性成分-基因靶点网络，获得8个中药节点、50个主要有效成分节点和257个基因靶点节点，共315个节点，994条关系线，见图1。浅紫色代表白术活性成分，粉色代表半夏活性成分，橙红色代表陈皮活性成分，玫红色代表茯苓活性成分，粉绿色代表枳实活性成分，矢车菊色代表天南星活性成分，栗梅色代表菟丝子活性成分，因泽兰的活性成分均与其他药物重复，故将其设为土黄色和橙色。进一步对网络图进行分析可知，加味二陈汤中与基因靶标联系最为密切活性成分是为柚皮素(naringenin)、槲皮素(quercetin)、、豆甾醇(Stigmasterol)、β-谷甾醇 (β-sitosterol)、川陈皮素(nobiletin)，见表3。

图1 加味二陈汤中药-活性成分-基因靶点网络图

表3 与基因靶点关系密切的活性成分及相关信息

2.4 PCOS疾病相关靶点筛选基于GeneCards、OMIM、Drugbank和Disgenet数据库筛选PCOS的疾病基因靶点，结果显示，GeneCards数据库获得PCOS疾病基因靶点2 301个，运用Excel中的“MEDIAN”算法计算其相关性分数(relevance score)的中位数，然后按照“依据大于或等于中位数”的筛选标准进行筛选，最终获得 1 151 个疾病基因靶点。通过同样的操作，在各数据库获得基因靶标分别为OMIM数据库629个，Drugbank数据库36个，Disgenet数据库988个。去除重复值后合并汇集，最终获得疾病基因靶标2 354个。

2.5 绘制韦恩图及构建PPI模型图将加味二陈汤筛选获得的基因靶标257个与疾病基因靶点 2 354 个导入在线作图平台绘制韦恩图，显示共同基因靶点143个，见图2。用EXCEL筛出共同基因靶标，并导入STRIG 11.0平台获得PPI模型，图中共有142个节点，2 932条边，边代表共同基因之间的关联度，关联度随与边的粗细成正比；节点为具体的共同基因，见图3。

图2 加味二陈汤和PCOS韦恩图

图3 加味二陈汤和PCOS相互作用PPI模型图

2.6 加味二陈汤与PCOS相互作用核心靶基因将PPI模型导入CytoScape 3.7.1，用Tools工具分析网络拓扑属性，以进一步分析PPI模型的核心靶基因。核心靶基因为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1(Akt1)、白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、肿瘤蛋白P53(tumor protein 53，TP53)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGFA)、丝裂原活化蛋白激酶3(mitogen activated prtotein kinases 3，MAPK3)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)、JUN原癌基因、MAPK1、表皮生长因子受体(epithelial grouth factor receptor，EGFR)、细胞凋亡相关半胱氨酸肽酶3(caspase 3，CASP3)、基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9，MMP9)、表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)、MAPK8、前列腺素-过氧化物合酶-2、原癌基因蛋白、ESR1、G1/S特异性细胞周期蛋白D1、2，4-双烯酰辅酶A还原酶1、原癌基因c-Fos、MMP2、磷脂酰肌醇3，4，5-三磷酸肌醇3-磷酸酶和双特异性蛋白磷酸酶，见图4。

图4 加味二陈汤和PCOS相互作用核心靶基因图

2.7 GO富集分析共有基因靶点的GO富集分析在DAVID数据库完成，包括生物过程(biological process，BP)、分子功能(molecular function，MF)和细胞组成(cellular component，CC)等3个部分，其中BP共得637个条目，按照富集基因数量进行排序，前20个条目主要涉及转录正调控、负调控、药物反应、凋亡过程及其调控、细胞增殖负调控、雌二醇反应等生物过程，见图5。MF共得111个条目，其按照富集基因数筛选得的前20条主要涉及蛋白结合、酶结合、DNA结合、ATP结合、转录因子结合及活性等分子功能，见图6。CC共得65个条目，前20条目主要参与核、细胞质、质膜、细胞外区域等细胞组分的组成，见图7。图中Rich Factor为富集于此功能中的基因与所有位于此功能的基因的比值，富集程度与比值成正比；气泡的大小表示基因数，气泡越大表示富集的基因数与气泡成正比，而颜色越红则显著性越高。

图5 共同基因靶点GO功能分析生物过程气泡图

图6 共同基因靶点GO功能分析分子功能气泡图

图7 共同基因靶点GO功能分析细胞组成气泡图

2.8 KEGG通路富集分析143个共有基因靶标进行KEGG富集分析在DAVID数据库完成，得到121个条目，根据条目富集的基因数量进行排序，前20个条目主要涉及PI3K/Akt、MAPK、TNF等多条信号通路，见表4，选择前20个条目作气泡图，见图8，气泡越大表明该通路富集的共同基因靶点靶点通路富集数量越多。

表4 共同基因靶点KEGG通路富集前20个条目

图8 共同基因靶点KEGG通路富集气泡图

3 讨论

本研究通过网络药理学方法对加味二陈汤进行活性成分、靶点与疾病的生物学信息的网络构建，探讨该复方对PCOS的作用机制。研究通过TCMSP平台筛选、Uniprot数据库规范化及Cytoscape3.7.1软件可视化处理后发现，加味二陈汤涉及靶点前5位的活性成分分别为槲皮素、β-谷甾醇、柚皮素、豆甾醇和川陈皮素。槲皮素是自然界分布最广的黄酮类之一[11]，具有调节激素水平紊乱及治疗PCOS各种并发症的作用[12]。研究表明，槲皮素能够通过抑制PI3K信号通路并下调CYP17A1基因，同时具有抗雄激素的作用，可以降低睾丸激素水平，还能将低水平的雌二醇和孕酮逆转至近乎正常水平[13-14]。槲皮素可降低促黄体生成素水平，还能增强脂联素活性等途径从而降低胰岛素抵抗[12]。POCS通常伴有血脂异常、肥胖等并发症[15]，血脂升高是PCOS 血管内皮损伤的重要因素[16]，而β-谷甾醇、豆甾醇作为甾醇成分均能抑制胆固醇吸收与合成、干扰三酰甘油吸收，从而改善体内血脂水平[17]。柚皮素是一种天然黄烷酮，具有消炎、镇痛的作用，HONG YL等[18]研究指出，柚皮素能显著提高活性氧清除酶、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶的水平，能防止PCOS大鼠体质量过度增加，还可显著降低血清葡萄糖水平，并通过降低PCOS大鼠模型中类固醇生成酶3β-羟基类固醇脱氢酶和17β-羟基类固醇脱氢酶的活性来降低雌二醇、睾丸激素的水平，减弱类固醇生成酶的活性，以维持卵巢的正常解剖结构。川陈皮素是一种多甲氧基黄酮类化合物，其能抑制炎症介质产生、抗糖尿病胰岛素抵抗从而对PCOS的发生起到一定的治疗作用[19]。

此外，根据靶点预测结果显示，加味二陈汤治疗PCOS的潜在核心靶点包含Akt1、IL-6、TP53、TNF、JUN、MAPK1、MAPK3、MAPK8、PTGS2、ESR1、PTEN等。而研究显示，MAPK1、TP53和MAPK9可能是PCOS卵巢组织中自噬相关基因被广泛激活的原因[20]。PCOS被认为是慢性低度炎症性疾病，临床上常伴有性激素水平紊乱、胰岛素抵抗，而在患者卵巢组织中检测出IL-6、TNF-α水平升高，这可能是维持PCOS低度炎症的关键原因。TNF-α由脂肪细胞、巨噬细胞等释放，是重要的炎症因子，研究表明，TNF-α表达上调能够诱导卵泡颗粒细胞凋亡、激活卵泡膜间质细胞有丝分裂，卵泡颗粒细胞减少而卵泡膜间质细胞增加，最终导致出现雌激素合成障碍、雄激素合成增多的现象[21]。还有研究表明，TNF-α参与调节糖脂代谢并与胰岛素抵抗相关，还参与了卵巢卵泡膜细胞的增殖和类固醇生成[22]。PTEN是抑癌基因，具有脂质磷酸酶和蛋白磷酸酶双重磷酸酶活性，可通过雌二醇对子宫内膜细胞磷酸化的影响调节内膜细胞的增殖与凋亡。PTEN还与胰岛素抵抗相关，miR-499-5p参与了胰岛素抵抗过程，而PTEN是miR-499-5p的靶基因，研究表明下调miR-499-5p水平可通过靶向PTEN破坏PI3K/AKT/GSK信号通路和糖原合成[14]。

KEGG富集分析显示，加味二陈汤的潜在作用靶点富集在PI3K/Akt和MAPK信号转导通路，这两条通路恰好是经典的胰岛素信号转导途径。PI3K/Akt信号通路介导胰岛素的促进代谢作用，比如糖原合成等，是胰岛素参与糖代谢的关键途径，也是卵巢功能的物质基础[23]。胰岛素样生长因子、胰岛素等与自身受体结合后激活受体，受体发生酪氨酸磷酸化，PI3K的亚基则与这些受体结合从而解除对自身的抑制，继而激活 PI3K/Akt信号通路。MAPK信号传导通路是胰岛素的促分裂的途径，参与细胞生长、增殖、分化。随着研究深入，越来越多研究表明，PI3K/Akt与自噬、胰岛素抵抗、糖代谢、脂肪代谢相关。正常水平的自噬可清除细胞的有害物质及受损细胞器，从而维持细胞的正常功能。PI3K可与相关自噬蛋白形成复合体，调控其他自噬蛋白定位到自噬前体的结构，导致PCOS卵巢组织PI3K/Akt/mTOR信号通路失调[17]。还有研究表明，子宫内膜上皮细胞的Akt过度磷酸化导致内膜上皮不典型增生[23]，且PI3K/Akt作用于卵巢颗粒细胞，影响小卵泡的发育，导致PCOS患者无法形成优势卵泡，进而影响排卵功能[24]。此外，PCOS患者伴有胰岛素抵抗导致高胰岛素状态，可引发高雄激素血症，可能与PI3K/Akt、MAPK/ERK1/2这两条信号转导通路相关[25]。

综上所述，加味二陈汤主要通过PI3K/Akt信号转导通路发挥治疗PCOS的作用，同时还能通过降低睾丸激素、雌二醇、促黄体生成素的激素水平，抑制胰岛素抵抗及调控自噬水平以恢复卵巢功能，并通过降低胆固醇、三酰甘油水平调节体内脂质代谢。加味二陈汤治疗PCOS具有多成分、多靶点的特点，涉及多条信号通路，可见其发挥治疗PCOS机制的系统性和复杂程度。网络药理学分析结果揭示了加味二陈汤活性成分、潜在作用靶点、PCOS疾病靶点及相关信号通路，为进一步研究药理作用机制提供了新思路。