基于网络药理学探究棘豆止咳散防治慢性阻塞性肺疾病的机制研究

盛松　李婧　扎拉嘎白乙拉

摘要目的：采用网络药理学方法研究棘豆止咳散（JDZKS）治疗慢性阻塞性肺疾病（COPD）的作用机制。方法：利用数据库、基因芯片等预测JDZKS治疗COPD的靶点，构建成分治疗靶点（CT）网络、治疗疾病靶点（TD）网络并计算网络贡献指数、Degree、Betweenness和Closeness筛选主要核心成分和靶点。对治疗靶点进行富集分析，最后对核心成分和靶点分子对接验证。结果：预测得到治疗靶点116个，根据网络贡献指數、Degree、Closeness和Betweenness筛选CT和TD网络得到2个核心成分和5个核心靶点。GO和KEGG分析显示JDZKS从炎症、氧化应激、细胞凋亡、抗感染、营养代谢等方面防治COPD，组织富集分析显示治疗靶点富集于多个器官组织。分子对接结果表明核心成分与核心靶点间具有较强的结合力。结论：JDZKS治疗COPD具有多成分、多靶点的特点，理论上可以从多角度、多层次防治COPD。

关键词棘豆止咳散;网络药理学;慢性阻塞性肺疾病;基因芯片;网络效能;贡献指数;核数;分子对接

Mechanism of Jidou Zhike Powder in Treatment of Chronic Obstructive Pulmonary

Disease Based on Network Pharmacology

SHENG Song，LI Jing，ZHALAGA Baiyila

（1 Xiyuan Hospital，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100093，China;

2 Kulun Banner Hospital of Mongolian Medicine，Tongliao 028200，China）

AbstractObjective：To explore the mechanism of Jidou Zhike Powder（JDZK） in the treatment of chronic obstructive pulmonary disease（COPD） by network pharmacology.Methods：Therapeutic targets of JDZK on COPD were predicted by the databases and gene microarray.According to the calculation of contribution index，degree，betweenness，and closeness，the core compounds and therapeutic targets were chosen in the compoundtarget network（CT） and the targetdisease（TD） network.Furthermore，therapeutic targets underwent enrichment analysis.Finally，the binding capacity between the core compounds and targets was verified by molecular docking.Results：A total of 116 therapeutic targets were obtained by prediction.In addition，two core compounds and five core targets were obtained in the CT network and the TD network according to the contribution index，degree，betweenness，and closeness.Furthermore，GO and KEGG analyses indicated that JDZK acted on COPD from inflammation，oxidative stress，cell apoptosis，infection resistance，and nutrition metabolism.Tissue enrichment analysis indicated that the therapeutic targets were enriched in multiple organs and tissues.Molecular docking results manifested excellent binding capacity between core compounds and core targets.Conclusion：JDZK treatment of COPD is characterized by multiple components and targets，which can prevent and cure COPD at multiple levels theoretically.

KeywordsJidou Zhike Powder; Network pharmacology; Chronic obstructive pulmonary diseases; Gene microarray; Networkbased efficacy; Contribution index; Coreness; Molecular docking

中图分类号：R289.5;R563文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2022.04.003

慢性阻塞性肺疾病（Chronic Obstructive Pulmonary Disease，COPD）是一种以呼吸道持续气流受限为特征的肺部疾病，是呼吸系统的常见病和多发病。慢性阻塞性肺疾病全球创议（The Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease，GOLD）预计COPD的发病率在未来40年仍会继续上升，至2060年每年有超过540万人死于COPD及其相关疾病[1]。中医学从宏观着手，整体施治，理论上可以从多角度、多层次出发防治COPD，更好地提高疗效。棘豆止咳散（JDZKS）是内蒙古通辽地区的常用蒙药制剂，组方中多叶棘豆为君药，川贝母为臣药，石膏为佐药，甘草为使药，在长达30年的使用过程中发现JDZKS对于COPD导致的咳嗽、肺气肿等具有较好疗效[2]。

然而由于复方成分的复杂性和药理作用的多靶点、多途径、多环节的特点，采用传统单靶标、单成分的研究思路来研究JDZKS干预COPD的作用机制很难体现复方的系统性，难以科学解释JDZKS的药效物质基础[3]。网络药理学是从系统水平研究药物与人体相互作用规律及机制的一门新兴学科，因其整体性和系统性的特点已被广泛应用于复方主要活性成分筛选、作用靶点预测及作用机制研究[4]。因此我们借助网络药理学方法从整体角度探究JDZKS干预COPD的作用机制（图1），为JDZKS的系统深入研究提供理论基础。

1材料与方法

1.1筛选JDZKS的成分本研究通过中药系统药理学数据库与分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）检索川贝母、甘草化学成分，并根据口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）和类药性（Drug Likeness，DL）筛选得到符合条件的候选化合物[5]。因复方中多叶棘豆和石膏未在TCMSP中收录，本研究通过TCMID（http：//www.megabionet.org/tcmid/）及文献检索得到多叶棘豆和石膏的化学成分[67]。检索日期截至2020年3月1日。

1.2获取候选化合物的靶点首先将候选化合物分别导入TCMSP和PubChem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）得到化合物的mol2结构文件以及SMILES和InChI化学式，然后将其导入PharmMapper（http：//www.lilabecust.cn/pharmmapper/）、SwissTargetPrediction（http：//www.swisstargetprediction.ch/）、DrugBank（https：//www.drugbank.ca/）、BatmanTCM（http：//www.swisstargetprediction.ch/）分别依据反向药效基团、化合物结构相似性及药物靶点关系的方法预测化合物靶点[810]，同时为保证预测靶点的准确性，在上述4个网站中分别以Norm Fit≥0.7、Probability≥0.7、Similarity threshold=0.7、Score cutoff=20为条件进一步筛选靶点，最后将4个数据库的预测靶点汇总去重后导入Uniprot（https：//www.uniprot.org/）中校正为Gene symbol，作为JDZKS的成分靶点。检索日期截至2020年3月1日。

1.3筛选COPD靶点COPD靶点预测来自数据库和GEO基因芯片。以“chronic obstructive pulmonary disease”和“COPD”为关键词检索数据库GeneCards（http：//www.genecards.org/）、GAD（https：//geneticCHDsociationdb.nih.gov/）、TTD（http：//bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/）、DisGenet（http：//www.disgenet.org/）和DrugBank得到COPD靶点。GSE37768是GEO（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中收录的一个包含18例COPD患者和9例未吸烟健康人周围肺组织样本的基因表达数据集。首先利用该数据集提供的GPL570平台注释文件将27个样本的探针ID转换为Gene symbol，然后使用R version3.6.0的Impute包、Affy包、Limma包进行数据集的缺失数据插补、标准化以及差异基因识别，差异基因阈值设置为P<0.05且| Log2 fold change |≥1。为保证疾病靶点预测的准确性，将上述6个来源的COPD靶点两两取交集得到疾病靶点，最后将JDZKS成分靶点与COPD疾病靶点再取交集得到JDZKS治疗COPD的靶点，即治疗靶点。检索日期截至2020年3月1日。

1.4网络分析和构建Cytoscape（ver3.2.1）是一款图形化显示网络并进行分析和编辑的软件，能更直观地分析药物治疗疾病的作用机制[11]。网络中节点是成分或靶点，边代表成分靶点关系或靶点靶点关系。

1.5成分治疗靶点（CT）网络构建及分析利用候选化合物、治疗靶点及其之间的联系构建CT网络，同时参考文献本研究引入了贡献指数（Contribution Index，CI）以评估候选化合物对CT网络的单独贡献程度，CI的计算主要基于网络效能（Network Based Efficacy，NE）和PubMed文献，如果排名前N个化合物的CI之和大于85%，则这N个化合物被认为是对CT网络贡献度最大的核心成分[12]，CI计算公式如下。

在公式（1）中，n是与化合物j连接的靶点数量，d（i）是与化合物j连接的靶点i的Degree值。在公式（2）中，m是网络中的化合物数目，c（j）是化合物j与COPD的相关PubMed文献数目，检索策略为在Abstract/Title中以“chronic obstructive pulmonary disease”“COPD”和网络中化合物英文名称及别称为关键词联合检索PubMed中1990—2019年的文献。

1.6治疗疾病靶点（TD）网络构建及分析将治疗靶点导入STRING（https：//stringdb.org/），其中“organism”限定为“Homo sapiens”“minimum required interaction score”設定为“medium confidence（>0.400）”得到靶点间互作关系，然后用治疗靶点及疾病靶点间的蛋白质相互作用关系构建TD网络，最后通过Cytoscape的Network Analyzer功能计算网络中Degree、Betweenness和Closeness评估TD网络中节点的重要性，通常一个节点在网络中的重要性与Degree、Betweenness和Closeness值成正比。参照既往文献筛选网络中大于2倍Degree均值的靶点，在此基础上再筛选同时大于Degree、Closeness和Betweenness均值的节点定义为核心靶点[13]。

1.7富集分析本研究使用R进行基因本体（GO）富集分析和京都基因和基因组百科全书（KEGG）富集分析，首先应用Org.Hs.eg.db包将治疗靶点的gene symbol转换为EntrzID，然后运用ClusterProfiler包进行富集分析，根据Adjusted P<0.05作为条件筛选富集条目，最后使用Enrichplot包和Ggplot2包绘制柱状图及气泡图展示富集结果。利用TissueEnrich平台（https：//tissue.gdcb.iastate.edu/）分析和可视化治疗靶点的组织器官定位[14]，根据Adjusted P<0.05作为条件筛选显著富集的组织器官。

1.8分子对接iGEMDOCK（http：//gemdock.life.nctu.edu.tw/dock/，ver2.1）是一款开源的分子对接软件，具有对接快速、准确度高的优点[15]。一般来说，结合亲和力是由结合自由能决定的。当结合构象稳定时，能量相对较低[16]。在TCMSP中下载核心成分结构的mol2格式文件，在PDB（https：//www.rcsb.org/）中下载核心靶点蛋白结构的PDB格式文件。对接前使用Discovery Studio（version 2016）对靶点蛋白进行去水、加氢、删除原始配体等预处理，删除的配体另存为mol2格式文件。软件采用“standard docking”对接，其余对接参数均为默认。

2结果

2.1筛选JDZKS的成分筛选得到JDZKS成分144个，其中在TCMSP中以“OB≥30%，DL≥0.18”作为筛选条件得到甘草成分75个，川贝母成分11个，通过TCMID及文献得到多叶棘豆成分60个，石膏成分1个，其中Isorhamnetin和山柰酚为多叶棘豆和甘草共有成分，Sitosterol为川贝母和甘草共有成分。

2.2获取候选化合物的靶点上述4个数据库得到812个成分靶点，包括甘草靶点688个，川贝母靶点183个，多叶棘豆靶点329个，石膏靶点19个。

2.3筛选COPD靶点将上述6个来源的疾病靶点（5个数据库和GEO芯片）两两取交集得到COPD靶点932个，成分靶点与COPD靶点再取交集共得JDZKS治疗COPD靶点168个，包括靶点川贝母28个，甘草144个，多叶棘豆78个，石膏6个，其中川贝母、甘草、多叶棘豆共同靶点14个，川贝母、甘草共同靶点13个，川贝母、多叶棘豆共同靶点1个，甘草、多叶棘豆共同靶点45个，多叶棘豆、石膏共同靶点1个，这表明JDZKS在治疗COPD过程中既有特异性的作用靶点可单独发挥作用，又有共同的作用靶点协同发挥作用，两药可“相须相使”治疗COPD。

2.4CT网络构建及分析在CT网络中有节点270个，边849条，代表106个化合物成分，其中川贝母9个，甘草59个，多叶棘豆34个，石膏1个，共有成分3个和164个成分靶点。见图2A。图2A网络中不同颜色的圆圈代表JDZKS中各个药物的成分，紫色方块代表成分靶点。如上所述根据CT网络中每个化合物的NE和PubMed文献数计算CI，结果表明，槲皮苷和山柰酚这2个化合物的CI之和大于85%，是對CT网络贡献度最大的核心成分。见图2B。即JDZKS抗COPD的主要活性化合物。

2.5TD网络构建及分析在TD网络中有165个节点和668个边。见图3A。其中AKT1、TNF、EGFR、SRC、IL1B、PTGS2、CAPS3、EGF、ESR1、IGF1、MMP9、IL10、PPARG、ERBB2、ACTB、FGF2、APP、AR这18个靶点的Degree大于2倍Degree均值（Degree>40.44）。见图3B。在18个靶点基础上再筛选同时满足大于Degree、Closeness和Betweenness均值（Degree>59.17，Closeness>0.58和Betweenness>0.035）的节点定义为核心靶点，即AKT1、TNF、EGFR、SRC、IL1B。见图3C。进一步提取的5个核心靶点及其相邻节点构建核心靶点网络，该网络显示，5个核心靶点与网络中74.5%（123/165）的治疗靶点有互作关系。见图3D。是网络中的核心节点。在上述4个图中节点的大小与Degree值成正比，颜色变化与节点Degree值相关。

及相邻节点提取网络

2.6富集分析本研究使用R对JDZKS治疗COPD的168个靶点进行GO和KEGG分析。根据Adjusted P<0.05确定2 791个GO富集条目，其中生物过程（BP）2 503个，主要涉及类固醇代谢过程、氧化应激反应、营养反应、对营养水平的反应、类固醇激素反应等方面;分子功能（MF）206个，主要包括核受体活动、转录因子活性和直接配体调控序列、类固醇结合、类固醇激素受体活性、血红素结合等方面;细胞组分（CC）81个，主要关于膜筏、膜微结构域、膜区域、质膜筏、小凹等。见图4A。根据Adjusted P<0.05共得到146条通路，排名前30的通路中经查找文献确认的COPD相关通路共9条，包括MAPK信号通路、PI3KAKT信号通路、黏着斑、人类巨细胞病毒感染、甲状腺激素信号通路、IL17信号通路、叉头转录因子信号通路、甾类激素生物合成、军团杆菌病。见图4B。其余的KEGG通路绝大多数可归属于人类疾病通路。KEGG分析表明JDZKS活性成分的作用靶点分布于不同的通路，多成分、多靶点相互调节是COPD的可能作用机制。组织富集分析显示168个治疗靶点显著富集于多个器官和组织，JDZKS治疗COPD是对全身多个组织和器官综合调控的结果，其中肝脏、胎盘、阑尾、骨髓、膀胱等组织器官在JDZKS治疗COPD过程中发挥重要作用。见图4C。

2.7分子对接对2个核心成分和5个核心靶点进行分子对接验证，分子对接结果表明Quercetin和Kaempferol与EGFR、IL1B、TNF这3个靶点的结合力均优于原配体，2个核心成分与5个核心靶点间具有较强的结合力，进一步间接证明了网络药理学预测的准确性。见图5。

3讨论

本研究发现，其余的KEGG通路绝大多数可归属于人类疾病通路，说明这些疾病可能与COPD潜在相关，如非小细胞肺癌（鳞癌）是COPD的独立危险因素，它们可能共享许多从疾病发生发展的病理演变过程[17]。COPD是近些年来备受关注的慢性疾病之一，近年来的研究表明COPD并不是单一的病理过程，气道炎症、氧化应激、蛋白酶/抗蛋白酶失衡，造成气道、肺实质和肺血管反复损伤修复而引起结构变化，最终导致气流受限和气体陷闭、黏液高分泌、气体交换异常和肺动脉高压[18]。所以通过干预图5分子对接自由结合能热图

某个特定靶点往往很难控制COPD进展，通过某个单体化合物延缓COPD患者肺功能恶化往往难以取得理想临床疗效。由多种天然药物组成的复方中含有各类生物活性成分，具有多成分、多靶点、多通路的作用特点，是治疗COPD这类由多种病理机制共同介导的慢性疾病的理想治疗手段。

本研究通过网络药理学从多个角度探究了JDZKS治療COPD的潜在的分子机制和靶点通路。CT网络及CI计算结果显示，甘草活性成分槲皮苷以及多叶棘豆和甘草共有成分山柰酚对网络贡献度最大，表示它们在JDZKS抗COPD中发挥主要作用，有着重要的潜在研究价值。既往研究证实槲皮苷是一种植物类黄酮，具有强大的抗氧化、抗炎、抗感染特性，在COPD小鼠模型中可显著降低氧化应激和肺部炎症标志物，并减少细菌计数，能有效预防COPD疾病进展[1920]。山柰酚可与抑制剂kappa B激酶2 （Inhibitor Kappa B Kinase 2，IKK2）ATP结合位点结合并通过磷酸化作用导致抑制IKK2，有助于预防COPD发生和恶化[21]，以上结果为我们提供了更多的研发中药单体治疗COPD药物的新线索。进一步的TD网络分析显示AKT1、TNF、EGFR、SRC、IL1B等5个核心靶点在JDZKS治疗COPD中尤为重要。后续的GO与KEGG分析显示JDZKS从炎症损伤、氧化应激、细胞凋亡、抗感染、营养代谢等方面干预COPD，发挥其治疗COPD并延缓患者肺功能恶化的作用。组织富集分析显示JDZKS治疗COPD是对全身多个组织和器官共同调控的结果，进一步印证了之前GO和KEGG的分析结果，即表明JDZKS从多角度、多层次出发防治COPD。分子对接结果表明槲皮苷和山柰酚与核心靶点具有较强的结合力，也进一步间接证明了网络药理学预测的准确性。

本研究通过网络药理学方法分析和探索了JDZKS治疗COPD的潜在物质基础与治疗靶点，为揭示其作用机制提供了理论基础以及为其后续试验的疗效评价指标筛选提供方向。但是需要注意的是，网络药理学研究尚存在一定局限性，如忽视了药物剂量、中药炮制、个体化差异带来的影响，其次数据库中成分靶点收录不全、信息更新滞后，不能完全揭示其药理作用，因此仍须进一步试验结果的验证与支持。

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（2020-09-02收稿本文編辑：张雄杰）实验研究

基金项目：内蒙古自治区应用技术研究与开发资金计划项目（201701111）——蒙药复方制剂棘豆止咳散的开发研究

作者简介：盛松（1987.01—），男，硕士，主治医师，研究方向：中西医结合防治心血管疾病，Email：747367050@qq.com

通信作者：扎拉嘎白乙拉（1972.02—），男，本科，主任医师，研究方向：蒙医防治脾胃疾病，Email：188638400@qq.com