情志应激激活潜伏单纯疱疹病毒1型建立“肝郁化火”动物模型的研究

姜珊　罗卓　梁磊　牛杰　龚海标　李娥　李怡芳　栗原博　何蓉蓉

摘要目的：建立情志應激引起潜伏单纯疱疹病毒1型（HSV1）复发的“肝郁化火”动物模型。方法：小鼠通过鼻滴感染HSV1 4周后，采用定量反转录聚合酶链式反应（qRTPCR）和空斑法分别检测三叉神经节（TG）中HSV1潜伏相关转录体（LAT）的表达和病毒颗粒，确定单纯疱疹病毒1型（HSV1）潜伏模型成功建立。小鼠每天拘束应激12 h，持续应激4 d，采用致细胞病变效应（CPE）法和免疫荧光法检测三叉神经节中HSV1的gB蛋白的表达，检测情志应激诱导HSV1激活情况。HSV1潜伏小鼠于拘束应激前3 d给予“清肝泻火”经典方丹栀逍遥散或清肺热的经典方泻白散，以方测证判定模型的中医证型。采用眼球摘除法对小鼠血浆进行取样，液质色谱质谱法（LCMS）检测各激素的含量。用Western Blotting法检测TG中脂质氧化指标4HNE和固有免疫指标干扰素β（IFNβ），肿瘤坏死因子α（TNFα）和白细胞介素6（IL6）蛋白的表达情况。结果：小鼠鼻滴感染HSV1 4周后，可在其三叉神经节中建立潜伏，小鼠拘束4 d后可再次激活。与激活组比较，丹栀逍遥散比泻白散更能有效降低HSV1的激活率，并能减轻复发性眼部感染。激活组以及丹栀逍遥散组的血浆中皮质酮水平都明显增加，2组差异无统计学意义。此外，丹栀逍遥散能降低TG中4HNE和IFNβ的表达，并能减少HSV1复发引起的TNFα和IL6炎症介质蛋白的表达。结论：丹栀逍遥散可增强固有免疫，降低情志应激介导的HSV1重激活，并能减轻HSV1激活复发而引起的氧化应激以及炎症反应。

关键词丹栀逍遥散;情志应激;单纯疱疹病毒1型;潜伏激活;肝郁化火;脂质过氧化;中医动物模型

Establishing an Animal Model of Emotional Stress Activated Latent HSV1

for TCM Theory “Liver Qi Stagnation Forming Huo”

JIANG Shan，LUO Zhuo，LIANG Lei，NIU Jie，GONG Haibiao，LI E，LI Yifang，LI Yuanbo，HE Rongrong

（1 Jinan University Guangdong Engineering Research Center of Chinese Medicine & Disease Susceptibility，Guangzhou 510632，

China; 2 Institute of Traditional Chinese Medicine and Natural Products，College of Pharmacy，Jinan University，Guangzhou

510632，China; 3 School of Traditional Chinese Medicine，Jinan University，Guangzhou 510632，China）

AbstractObjective：To establish an animal model of emotional stress activated latent HSV1，which is suitable for studying the TCM theory of “Liver qi stagnation forming Huo”.Methods：The expression of HSV1 latent associated transcripts（LAT） and virus particles in trigeminal ganglion（TG） were detected respectively by RTqPCR and plaque assay，to confirm the successful establishment of HSV1 latent model in mice after 14 days of nasal infection.To detect the HSV1 activation induced by emotional stress，the mice were daily subjected to restraint stress for 12 hours for 4 days.Following restraint stress，the TG of the mice was collected and the expression of gB protein in TG was measured by cytopathic effect（CPE） and immunofluorescence method.The mice in the latent phase of HSV1 were treated with Danzhi Xiaoyao Powder which was a classic recipe for clearing liver heat or Xiebai Powder that had the effects of clearing lung heat three days before the restraint stress.And the TCM syndromes type of the model was determined by the method of “Syndrome Differentiation through Formula Effect Assessment”.At the same time，the plasma of the mice was sampled by enucleation method，and the content of hormones was detected by LCMS.The expression of lipid oxidation indicator 4HNE and innate immune index IFNβ，TNFα and IL6 proteins in TG were measured by Western Blotting method.Results：HSV1 latent infection could be established in the TG of mice after 4 weeks nasal infection and it could be reactivated after being restrained for 4 days.Compared with the activated group，the Danzhi Xiaoyao Powder could significantly reduce the activation rate of HSV1 and recurrent eye infections than Xiebai Powder.The plasma corticosterone（CORT） level in the reactivated group and the Danzhi Xiaoyao Powder group were increased significantly.However，no significant difference between the two groups was observed.Moreover，the expression of 4HNE and IFNβ in TG was significantly reduced by Danzhi Xiaoyao Powder.Danzhi Xiaoyao Powder can also reduce TNFα and IL6 inflammatory proteins in TG induced recrudescent HSV1.Conclusion：Danzhi Xiaoyao Powder can enhance innate immunity and reduce stressmediated HSV1 reactivation，and it can alleviate the oxidative stress and inflammation response caused by HSV1 reactivation.

KeywordsDanzhi Xiaoyao powder; Emotional stress; HSV1; Latent activation; Liver qi stagnation forming Huo; Lipid peroxidation; Animal model of traditional Chinese medicine

中图分类号：R275文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2022.04.005

在中医理论中，“火”（包括温、热）为阳盛之气所化生，多属内热，由情志应激、起居不节、嗜食辛辣、熬夜等因素会造成“上火”。情志内伤，抑郁不畅，影响机体阴阳及脏腑的生理平衡，造成气机郁结，气郁日久则从阳化热，火热内生，即“五志过极化火”，最常见的是“肝郁化火”[1]。“肝郁化火”是情志致病的核心内容，是一种病机，也是一种证候，是指情志不遂，引起肝气郁结，郁久而转化成“上火”的状态。然而，至今为止没有适合研究“肝郁化火”的动物模型，也限制了“清肝泻火”中药药效的表征和机制研究。肝郁化火广泛存在于各种相关疾病的病理过程中，是情志致病病机转变的关键环节，由单纯疱疹病毒1型（Herpes Simplex Virus Type 1，HSV1）复发感染引发的口唇疱疹（中医称“热疮”）是“肝郁化火”最为常见的症状之一[2]。

HSV1是一种至少能够编码80种蛋白的双链DNA病毒，并将人类作为其唯一的天然宿主[3]。HSV1在人群中普遍存在，据流行病学统计，HSV1的全球感染率接近90%。HSV1经皮肤黏膜感染后，在鼻、口腔和眼睛等处引起疱疹性的病变[4]。尤为重要的是，在引起原发感染后，少量的病毒能进入神经末梢并沿轴突逆行至神经元胞体，并在中枢神经系统建立终身的潜伏感染[5]。当机体处于情志抑郁不畅，易形成肝气郁结，郁久而化火，导致肝脏阳热亢盛，气火上冲，围绕肝经巡行的颜面部位形成“火热”症状。如眼部红肿、口唇皮肤黏膜交界处反复出现成群小疱并伴有刺痛、发红、肿胀、发痒或灼热感，充满液体的水泡形成后可迅速破溃，遗留溃疡并结痂，这些症状与潜伏的HSV1病毒复发症状高度相似，严重者可进一步引发角膜炎、脑炎等其他严重疾病。于是，我们从情志应激导致HSV1复发感染的角度来建立“肝郁化火”的研究模型。在本研究中采用了拘束应激模型来模拟情志应激，该应激模型被认为是可以更好理解中医“肝”的功能，并被建议用于肝郁研究，因其可能有利于模拟或说明情志致病的部分过程。丹栀逍遥散由牡丹皮、栀子、柴胡和茯苓等9味药材组成，具有抗炎解热、疏肝解郁的功效，是治疗肝郁化火证的经典名方[6]。因此，我们基于“以方测证”在证候模型中应用的依据，采用丹栀逍遥散针对这一模型进行了干预研究，结果显示给予丹栀逍遥散的小鼠病毒激活復发率明显下降，复发性眼部炎症得到缓解。进一步研究表明，丹栀逍遥散并不影响情志应激诱导的皮质酮水平，但能显著增加干扰素β（IFNβ）的水平和抑制HSV1激活复发引起的脂质氧化和炎症反应。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1动物4周龄雄性BALB/c小鼠，购于广东省医学实验动物中心，实验动物许可证编号：SCXK（粤）20180002。伦理审批号：[2019]伦审批科026号。饲养温度为25 ℃，相对湿度为55%，12 h明暗交替环境，标准饲料和水喂养。小鼠适应性喂养1周后进行实验。本研究涉及的动物感染实验和动物样本采集在生物安全Ⅱ级（BSL2）实验室进行，动物饲养于P2实验室。

1.1.2病毒和细胞本研究用的HSV1毒株（F株）的扩增在Vero细胞上进行。Vero细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养。Vero细胞和HSV1毒株（F株）由暨南大学王一飞课题组馈赠。

1.1.3药物丹栀逍遥散组成为牡丹皮9 g、栀子9 g、柴胡9 g、茯苓12 g、白术9 g、当归9 g、白芍12 g、炙甘草6 g、薄荷6 g、生姜3片。泻白散组成为地骨皮30 g、桑白皮30 g、炙甘草3 g。上述药物均购于正规药店，按所列剂量精确称取。分别按500 mL常规煎制并按人体用量的9倍浓缩定容，使其分别形成相当于生药含量1.215 g/mL和0.945 g/mL的药液，4 ℃冰箱保存备用。临用前置于20 ℃环境下预热。

1.1.4试剂与仪器超声粉碎机（北京润泽康生物科技有限公司，型号：KBS1200）;3K15台式高速冷冻离心机（Sigma公司，德国，型号：CR1260）;CO2细胞培养箱（赛默飞世尔科技有限公司，美国，型号：120300）;qPCR仪（BioRad公司，美国，型号：1708882AP）;高效液相色谱质谱联用仪（赛默飞世尔科技有限公司，美国，型号：4.80112.2500）;荧光显微镜（尼康公司，日本，型号：ECLIPSE Tis）;蛋白胶成像系统（广州誉维生物科技仪器有限公司，型号：14T12NPFL161239）;胎牛血清（上海碧云天生物技术有限公司，货号：C0234）;DMEM（上海生工生物工程股份有限公司，货号：E6000080500）;反转录试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，货号：RP110550T）;甲酸（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，货号：F112034）;乙腈（上海麦克林生化科技股份有限公司，货号：A800362）;gB抗体（Santa Cruz公司，美国，货号：SC69798）;GAPDH抗体（杭州费德生物技术有限公司，货号：FD0068）;4HNE抗体（Abcam公司，英国，货号：ab46545）;IFNβ抗体（Abcam公司，英国，货号：ab85803）;TNFα抗体（广州佰汇生物科技有限公司，货号：200946）;IL6抗体（北京义翘神州科技股份有限公司，货号：90197RP01200）;山羊抗小鼠IgG（H+L）HPR（杭州弗德生物科技有限公司，货号：FDM007）;山羊羊抗兔IgG（H+L）HPR（杭州弗德生物科技有限公司，货号：FDR007）。

1.2方法

1.2.1分组与模型制备分别将BALB/c小鼠随机分成正常对照组和病毒感染组。用异氟烷轻度麻醉后，用滴鼻的方式给正常对照组小鼠滴入纯DMED（20 μL/只），给病毒感染组小鼠滴入相同剂量的HSV1病毒（1×106 PFU）。感染操作结束后，将小鼠放回动物饲养房，待小鼠自然苏醒。4周后将存活下来的小鼠随机分为潜伏组、激活组、丹栀逍遥散组和泻白散组。

1.2.2给药方法给予激活组、丹栀逍遥散组和泻白散组拘束应激处理，即将小鼠置于50 mL通风拘束管中，每天拘束12 h，连续拘束4 d。在此期间，所有小鼠禁水禁食。丹栀逍遥散组和泻白散组于拘束前3 d开始分別灌胃给予上述制备的丹栀逍遥散（12.15 g/kg）和泻白散（9.45 g/kg），每次灌胃给药0.2 mL，1次/d，连续给药1周。潜伏组和激活组给予等体积的生理盐水。拘束完成后，立即对每组小鼠进行取血取材，用眼球摘除取血法取血，取材部位为三叉神经节。该研究通过动物福利伦理委员会批准。

1.2.3检测指标与方法

1.2.3.1定量反转录PCR（qRTPCR）法检测小鼠三叉神经节（TG）中病毒基因潜伏相关转录本（LAT）的表达用随机数字表法取正常对照组和潜伏组各3只小鼠的TG组织进行裂解，依照试剂盒方法提取样本总RNA，定量并检测样品RNA纯度，将提取的RNA用反转录试剂盒合成cDNA，扩增目的基因。逆转录反应体系20 μL，反应条件为37 ℃共15 min，85 ℃共5 s，4 ℃;PCR扩增反应体系为20 μL，反应程序为95 ℃共3 min，95 ℃共30 s，60 ℃共30 s，40个循环。引物由上海生工生物有限公司合成。引物序列：18S上游：TGACGTGGACATCCGCAAAG，下游：CTGGAAGG TGGACAGCGAGG扩增片段242 bp;LAT上游：CGGCGACATCCTCCCCCTAAGC，下游：GACAGA CGAACGAAACGTTCCG，扩增片段149 bp。

1.2.3.2空斑法检测小鼠TG中病毒的表达量将取出的三叉神经节用含2%双抗的冷磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤3遍，往三叉神经节中加入含10% FBS，1%谷氨酰胺，100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的DMEM培养液中，超声粉碎。将收集到的三叉神经节悬浮液经过3次反复冻融后，接种到Vero单层细胞上，放置于37 ℃，5%CO2培养箱中吸附3 h，弃去上清，用PBS洗3遍，加入含5% FBS，1%谷氨酰胺，100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的DMEM培养液，于培养箱中孵育4 d后，收集上清，重新接种到铺有Vero单层细胞的六孔板中，吸附3 h加入细胞覆盖液（0.5% FBS+0.5%羧甲基纤维素）1 mL继续培养7 d后，加入500 μL的4%甲醛溶液固定30 min后，吸弃甲醛固定液，加入1%结晶紫使用液500 μL，染色30 min。自来水冲洗，空斑呈现，计数。

1.2.3.3致细胞病变效应（Cytopathic Effect，CPE）法和免疫荧光法观察小鼠TG中gB蛋白的表达将取出的TG与Vero细胞共孵育（方法见上一段）后，连续7 d观察是否有CPE效应，并统计。弃去一半体积培养液，加入500 μL 4%多聚甲醛放置10 min，对细胞进行预固定，然后弃去预固定液体，加入1 mL 4%多聚甲醛放置15 min固定细胞，PBS洗3次，5 min/次。用0.1%的Triton X100透膜15～20 min，PBS洗3次，5 min/次。用5% BSA封闭1 h，PBS洗3次，5 min/次。加入100 μL TOM20（1∶200）一抗孵育液，4 ℃孵育过夜，第2天回收一抗孵育液，PBS洗3次，5 min/次，接着加入100 μL二抗孵育液（1∶300），避光室温孵育1 h，弃去二抗孵育液，PBS洗细胞3次，5 min/次;加入100 μL抗荧光淬灭剂，在荧光显微镜下初步观察荧光情况，接着使用荧光显微镜对其进行观察拍照，导出并处理数据。

1.2.3.4LCMS法检测血浆中各激素的含量拘束应激后，进行小鼠眼球摘除取血，取血2.0 mL，在4 ℃，以3 000 r/min的转速，13.5 cm的离心半径，离心10 min，取50 μL血浆，加3 μL可的松（1 μg/mL）作为内标，加600 μL甲基叔丁基醚，涡旋2.5 min，取上层，氮气吹干，加50 μL甲醇复溶，4 ℃ 12 000 r/min，离心半径8.79 cm离心15 min，取上清，进入液质联用仪，进行测样。液相色谱仪配备DAD检测器。色谱柱：Waters Acquity UPLC HSST3（1.8 μm，2.1 mm×100 mm），配备Van Guard预柱（1.8 μm，2.1 mm×5 mm）;流动相：0.1%甲酸水溶液（A）乙腈（B）;梯度洗脱程序如下：0～3 min，27%B;9 min，43%B;14 min，53%B;14.5 min，95%B;18.5 min，95%B;19～23 min，27%B，流速：0.25 mL/min;柱温：35 ℃;进样量：2 μL。质谱仪配备加热电喷雾离子源（Heated Electrospray Ionization，HESI）。质谱扫描模式为正离子扫描，一级扫描分辨率为70 000，扫描质量范围为150～1 000 m/z，最大注射时间为100 ms，二级扫描分辨率为17 500，最大注射时间为50 ms，分离窗口为2 m/z，碰撞能设置为30、40、50 eV。鞘气设置为35 arb，辅助气为10 arb，反吹气为1 arb。喷雾电压为3.5 kV。毛细管柱温为320 ℃，辅助气温度为350 ℃。

1.2.3.5Western Blotting检测TG中4羟基壬烯醛妇（4HNE）、干扰素β（IFNβ）、肿瘤坏死因子α（TNFα）和白细胞介素6（IL6）蛋白的表达利用总蛋白提取试剂盒提取各组小鼠TG中的蛋白，根据BCA试剂盒测定蛋白浓度。蛋白变性、上样、进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，湿法转膜60 min。4HNE（1∶1 000）、IFNβ（1∶1 000）、TNFα（1∶1 000）、IL6（1∶1 000）及GAPDH（1∶3 000）一抗稀释液，4 ℃孵育过夜;二抗稀释液室温孵育2 h。采用ECL发光后胶片暗室曝光显影。用Image J软件对图像进行分析，结果以目的蛋白与内参蛋白GAPDH的光密度比值表示。

1.3统计学方法采用GraphPad Prism 6.0软件统计分析，组间比较采用单因素方差分析（Oneway ANOVA），以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1情志应激引起潜伏HSV1激活动物模型的建立给小鼠鼻滴接种感染HSV1，4周后建立潜伏感染，然后连续拘束4 d，每天拘束12 h，诱导HSV1激活。见图1A。在未感染组的TG中没有检测到LAT的mRNA，在潜伏组的TG中检测到LAT的mRNA。见图2A。同时，用空斑法检测未感染组和潜伏组的TG中是否存在病毒颗粒。结果如图2B所示，发现在六孔板中未形成空斑，未感染组和潜伏组的TG中没有病毒颗粒。在镜下观察激活组的Vero细胞肿胀、变圆甚至飘起，正常组和潜伏组的Vero细胞呈梭形，细胞膜界限清晰，胞质透明度好，细胞形态完整，为正常状态。在荧光显微镜下观察到，激活组gB蛋白呈现绿色荧光，可清晰地检测到gB蛋白阳性信号。但是，在正常组和潜伏组中，未能检测到gB蛋白阳性信号。见图3。

2.2以方测证研究“清肝泻火”方对情志应激引起潜伏HSV1激活动物模型的干预作用丹栀逍遥散组大部分未形成空斑，激活组和泻白散组有空斑形成。见图4A。对每组小鼠进行统计，激活组的病毒激活率为70%，泻白散组的病毒激活率为60%，表明清“肺热”方剂泻白散对该模型没有明显的干预作用;而丹栀逍遥散组的病毒激活率为30%，表明清“肝火”方剂丹栀逍遥散能有效抑制情志应激引起的潜伏HSV1激活。见图4B。在给与小鼠拘束应激后，与激活组比较，丹栀逍遥散组的小鼠眼部感染症状明显减轻。见图5A。对每组小鼠的眼部炎症评分进行统计分析，激活组的小鼠角膜炎复发率为40%，丹栀逍遥散组的小鼠角膜炎复发率为10%。见图5B。

2.3丹栀逍遥散对情志应激复发小鼠应激激素水平的影响23个标准品在检测线内，检测到醛固酮、睾酮、孕烯醇酮、皮质酮、脱氧皮质酮和脱氧皮质醇这6种激素。见图6A。统计结果显示皮质酮水平明显升高，其他5种激素无明显变化。见图6B。丹栀逍遥散组和激活组的皮质酮水平都显著升高，但2组差异无统计学意义。见图6C。

2.4丹栀逍遥散对“肝郁化火”模型小鼠氧化应激、固有免疫和炎症介质的影响如图7A所示，与激活组比较，丹栀逍遥散组的4HNE表达明显降低，即丹栀逍遥散能显著降低4HNE的表达。如图7B所示，与激活组比较，丹栀逍遥散组的IFNβ蛋白表达明显增强，即丹栀逍遥散能显著增强IFNβ的表达。如图7C所示，与激活组比较，丹栀逍遥散组的TNFα蛋白和IL6蛋白表达明显下降，即丹栀逍遥散能显著减弱TNFα和IL6的表达。

3讨论

情志内伤，抑郁不畅，影响了机体阴阳及脏腑的生理平衡，造成气机郁结，气郁日久则火热内生，引起肝郁化火。肝郁化火证主要以火热之邪上攻头目所表现出来的面红目赤，口舌生疮、面部疱疹等临床表现为主。这症状可能与HSV1的感染有关[78]。情志应激是肝郁化火证的主要发病原因之一[9]，同时也是使HSV1激活复发的重要因素之一[1012]。丹栀逍遥散是治疗“肝郁化火”证的经典名方[6]。因此，建立情志应激诱导潜伏HSV1激活的肝郁化火型动物模型，可用于研究情志应激引起病毒易感的机制，并用于评价丹栀逍遥散这类清热中药的药效。

当HSV1处于潜伏期时，LATs是HSV1病毒在潜伏期间唯一大量存在和被转录的RNAs[13]。因此，本研究采用定量反转录PCR技术，扩增反应中每一个循环扩增产物的量，进行定量分析，监测细胞LAT mRNA表达量的变化。结果在未感染组的TG中没检测到LAT mRNA的表达，在潜伏组的TG中检测到LAT mRNA的表达。空斑形成实验是病理学研究中一种检测受试样品对病毒感染程度影响的经典实验方法[14]。我们将未感染组和潜伏组的TG均浆，接种到铺有一层致密Vero細胞的六孔板中，用空斑法检测病毒颗粒，结果在未感染组和潜伏组都未发现空斑，以上结果说明HSV1潜伏模型建立成功。HSV1编码的蛋白质分子已经明确的就多于80个，但是如此众多的编码基因并不是同时开始工作的，它们遵循一个线性的时间程序，即即刻早期、早期和晚期。而晚期基因编码的蛋白中有11种包膜糖蛋白，gB就是其中之一。因此，本研究采用细胞病变效应（Cytopathic Effect，CPE）法[15]和免疫荧光法检测gB蛋白，验证潜伏HSV1是否激活。为了考察丹栀逍遥散对情志应激引起潜伏HSV1激活动物模型的干预作用，我们采用空斑法检测激活后小鼠TG中的病毒颗粒。结果在丹栀逍遥散组中大部分未发现空斑，发现激活组的激活率为70%，丹栀逍遥散组的激活率为30%。以上结果说明，丹栀逍遥散明显降低了HSV1的激活复发率。有趣的是，通过观察我们发现丹栀逍遥散能减轻HSV1复发性眼部感染。有研究表明，情志的应激状态会显著影响机体的激素水平，导致内分泌系统的生理功能紊乱，引起HSV1的再激活[1617]。因此，为了探究丹栀逍遥散是否是通过改变机体的激素水平，而导致HSV1的潜伏激活率降低，我们用LCMS法检测小鼠血浆中各激素的水平变化。发现激活组和丹栀逍遥散组的皮质酮水平明显上升，但是这2组之间无显著性差异。以上结果说明，丹栀逍遥散并不影响拘束应激后皮质酮的水平，这表明其保护作用与皮质酮的分泌水平无关。有研究表明，由HSV1感染的不同细胞和动物模型都会发生氧化损伤[18]。氧化损伤是指当活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）的产生速度高于清除速度，浓度超过生理限度时，就会损伤生物大分子，如ROS氧化生物膜，破坏脂质结构。4羟基壬烯醛（4HNE）是ROS破坏生物膜结构的副产物之一。为了验证丹栀逍遥散是否能减轻HSV1激活复发引起的氧化损伤，我们用Western Blotting法观察TG中4HNE的变化情况，结果发现与激活组比较，丹栀逍遥散组的4HNE表达明显降低，即丹栀逍遥散能显著降低4HNE的表达。有研究表明，肝郁化火的情志应激状态可抑制机体对HSV1的固有免疫应答，使固有免疫系统抗病毒作用的代表性细胞因子干扰素β（IFNβ）表达下调[19]。为了验证丹栀逍遥散是否能增强HSV1的固有免疫应答，我们用Western Blotting法观察TG中IFNβ蛋白的变化情况，结果表明与激活组比较，丹栀逍遥散组的IFNβ蛋白表达明显增强，即丹栀逍遥散能显著增强IFNβ的表达。有研究表明肝气郁结会导致机体的免疫功能减弱，抵抗力下降，炎症反应增强，宿主通过机体产生大量炎症介质，如肿瘤坏死因子α（TNFα）和白细胞介素6（IL6）[20]。为了验证丹栀逍遥散是否能减弱HSV1激活复发引起的炎症反应，我们用Western Blotting法观察TG中TNFα蛋白和IL6蛋白的变化情况，结果发现与激活组比较，丹栀逍遥散组的TNFα蛋白和IL6蛋白表达明显下降，即丹栀逍遥散能显著减弱TNFα和IL6的表达。以上结果说明，丹栀逍遥散可增强固有免疫，并能减轻HSV1激活复发而引起的氧化应激和炎症反应。

本研究成功建立了情志应激引起潜伏HSV1激活复发的“肝郁化火”动物模型，并以“以方测证”为依据，采用丹栀逍遥散针对这一模型进行研究，发现丹栀逍遥散对这一模型有干预作用，可降低HSV1的激活复发率，缓解复发性眼部炎症，但其并不影响情志应激诱导的皮质酮水平，与皮质酮的分泌水平无关，可能是通过减轻氧化应激和炎症反应，增强固有免疫来干预潜伏HSV1的激活复发，但其具体的作用机制还有待更深入的探讨。目前，临床上主要用阿昔洛韦和喷昔洛韦等核苷类似物来治疗HSV1，但在治疗过程会出现不良反应和耐药性，最重要的是，这些药物无法对抗HSV1的激活复发感染[21]，目前世界上尚无有效的药物来阻止潜伏HSV1的重激活[22]。本研究对潜伏HSV1激活复发感染导致的相关疾病的中医药防治提供了一定的实验依据。

参考文献

[1]朱思睿，罗祥，李怡芳，等.情志“上火”增加“疾病易感性”的研究[J].中国中药杂志，2018，43（8）：15291535.

[2]汪琴静，包洁，李思敏，等.“上火”与病毒的相关性探讨[J].中国中医急症，2015，24（3）：453456.

[3]Bradley H，Markowitz LE，Gibson T，et al.Seroprevalence of herpes simplex virus types 1 and 2United States，19992010[J].J Infect Dis，2014，209（3）：325333.

[4]Piret J，Boivin G.Resistance of herpes simplex viruses to nucleoside analogues：mechanisms，prevalence，and management[J].Antimicrob Agents Chemother，2011，55（2）：459472.

[5]Whitley RJ.Herpes Simplex Virus Infections of the Central Nervous System[J].Continuum（Minneap Minn），2015，21（6 Neuroinfectious Disease）：17041713.

[6]陈蓉蓉.丹栀逍遥散加减联合情志干预疗法治疗肝郁化火型不寐的临床观察[J].中西医结合心血管病（连续型电子期刊），2019，7（28）：153154.

[7]孙志毅，宋继科，毕宏生.抑火清肝退翳汤加减治疗肝经风热型单纯疱疹性角膜炎的临床疗效及作用机制[J].中国实验方剂学杂志，2020，26（11）：124129.

[8]Yan C，Luo Z，Li W，et al.Disturbed YinYang balance：stress increases the susceptibility to primary and recurrent infections of herpes simplex virus type 1[J].Acta Pharm Sin B，2020，10（3）：383398.

[9]Pan MH，Zhu SR，Duan WJ，et al.“Shanghuo” increases disease susceptibility：Modern significance of an old TCM theory[J].J Ethnopharmacol，2020，250：112491.

[10]Becker HC.Influence of stress associated with chronic alcohol exposure on drinking[J].Neuropharmacology，2017，122：115126.

[11]Li W，Luo Z，Yan CY，et al.Autophagic degradation of PML promotes susceptibility to HSV1 by stressinduced corticosterone[J].Theranostics，2020，10（20）：90329049.

[12]Yu W，Geng S，Suo Y，et al.Critical Role of Regulatory T Cells in the Latency and StressInduced Reactivation of HSV1[J].Cell Rep，2018，25（9）：23792389.e3.

[13]Nicoll MP，Proena JT，Efstathiou S.The molecular basis of herpes simplex virus latency[J].FEMS Microbiol Rev，2012，36（3）：684705.

[14]孟繼鸿.细胞单层速成法病毒空斑试验在单纯疱疹病毒分型中的应用[J].南京铁道医学院学报，1986，8（2）：7.

[15]王巧利，于立坚，王一飞，等.土贝母苷甲对单纯疱疹病毒1型和2型的增殖和基因组复制的抑制效应[J].病毒学报，2019，35（4）：569577.

[16]Ives AM，Bertke AS.Stress Hormones Epinephrine and Corticosterone Selectively Modulate Herpes Simplex Virus 1（HSV1） and HSV2 Productive Infections in Adult Sympathetic，but Not Sensory，Neurons[J].J Virol，2017，91（13）：e0058217.

[17]罗卓，颜畅，李怡芳，等.Ⅰ型单纯疱疹病毒潜伏感染及其应激复发[J].中国药理学通报，2017，33（9）：11851190.

[18]De Chiara G，Marcocci ME，Sgarbanti R，et al.Infectious agents and neurodegeneration[J].Mol Neurobiol，2012，46（3）：614638.

[19]Ashcraft KA，Bonneau RH.Psychological stress exacerbates primary vaginal herpes simplex virus type 1（HSV1） infection by impairing both innate and adaptive immune responses[J].Brain Behav Immun，2008，22（8）：12311240.

[20]雷珊珊，潘小平，徐莉，等.复发性唇疱疹实热“上火”患者免疫功能变化[J].中华中医药学刊，2018，36（12）：28262831.

[21]Viswanathan K，Dhabhar FS.Stressinduced enhancement of leukocyte trafficking into sites of surgery or immune activation[J].Proc Natl Acad Sci U S A，2005，102（16）：58085813.

[22]Johnston C，Gottlieb SL，Wald A.Status of vaccine research and development of vaccines for herpes simplex virus[J].Vaccine，2016，34（26）：29482952.

（2021-01-26收稿本文編辑：吴珊）

基金项目：国家自然科学基金项目（81873209，U1801284，81622050）;珠江创新团队项目（2017BT01Y036）;珠江学者计划项目（GDUPS2019）;广州市科技计划基础与应用基础研究资助项目（907158833068，201903010062）

作者简介：姜珊（1997.03—），女，硕士研究生在读，研究方向：中药药理学，Email：1005921730@qq.com

通信作者：何蓉蓉（1983.01—），女，博士研究生，教授，博士研究生导师，研究方向：中医理论基础和中药作用机制，Email：rongronghe@jnu.edu.cn