人尿源性诱导多能干细胞在遗传病治疗中的应用前景＊

袁艳萍，郑志娟，李运伦

（1.山东中医药大学，山东 济南250355；2.山东中医药大学附属医院，山东 济南250014）

人类遗传病主要是在异源系统或动物模型中进行研究，其结论从未被直接检验过[1]。直至目前，随着干细胞在再生医学方面应用的推广，逐渐实现对完全在体外发育的患者源性细胞进行基因测序及生理测试。诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells, iPSCs）具有自我更新和多向分化能力，可以根据不同的重编程效率从不同的细胞类型中产生不同的细胞株[2]。人iPSCs 的细胞来源逐渐实现了非侵入性、简单、成本低的突破[3]。利用尿源性iPSCs 衍生的与疾病表征相关的细胞模型可以为个性化医学提供一种新的生物资源，这种新的资源被用于机制探索、测试新发现的化合物、基因编辑及治疗等，促进了遗传病精确化医疗的发展。

1 人尿源性诱导多能干细胞

1.1 人尿源性诱导多能干细胞的特征

干细胞在再生医学、细胞替代治疗及药物筛选等领域有着广泛的研究及应用前景。随着2006年日本京都大学YAMANAKA 教授研究的iPSCs 的出现[4]，iPSCs 在疾病模型复制、再生医学、药物筛选等领域的应用不断创新和扩展。iPSCs 重编程比较常见的细胞类型可能是皮肤成纤维细胞、脐带血、外周血、角质细胞，但这仍然需要活检，直接阻碍了研究需求中的自愿捐赠[5]。理想的方法应是通过非侵入性、简单及低成本的程序[6]，从健康受试者或任何年龄、性别、人种的患者中普遍获得最佳细胞来源。现代医学研究中，人类泌尿系统由一个复杂的小管网组成，在正常的生理条件下，成千上万的细胞从管状系统、输尿管、膀胱和尿道脱落，并散布在尿液中[7]。尿液细胞是一种身体垃圾，2012年有报道称脱落的肾上皮性尿液细胞能有效地产生iPSCs，而且尿液细胞也具有易获取、成本低、效率高且无伦理学问题等优势[3]。并有研究证实与人皮肤成纤维细胞或成人脂肪来源间充质干细胞（MSCs）相比，尿源性iPSCs 具有更快的重编程动力学[8]，与胚胎干细胞或其他来源的iPSCs 相比，尿源性iPSCs 表现出相似的表达和多能模式[9]。

1.2 尿液细胞重编程为iPSCs

iPSCs 重编程的原理指利用体细胞核移植（SCNT）、细胞融合、OSKM 转录因子及小分子转导等技术将维持干细胞特性的关键转录因子转移至成熟的体细胞内，将人成熟的体细胞重编程为人iPSCs，通过转录因子基因的异位表达从而具有干细胞特性[10]。

目前常用的重编程方法有通过慢病毒或逆转录病毒转导将重编程因子整合到基因组中[11]。这种方法可以实现高效的基因转移和长期表达，但由于外源基因永久和随机整合所产生的细胞有一定的致癌潜力，因此不适用于治疗。为避免使用整合病毒，目前逐渐出现不同类型的非整合重编程方法，如质粒转染[12]、游离载体[13]、仙台病毒[14]、mRNA[15]等的介导，与此同时能够模拟或替代重编程因子的小分子逐渐被发现[16]，如Valproic acid、CHIR99021、Vitamin C 等小分子。由于不同的细胞系的基因表达谱有差异，理想的重编程因子组合和诱导条件与细胞类型有很大的关联[17]。通过对文献的搜集整理，下面总结几种针对尿液细胞高效、低风险的重编程方法。

1.2.1 质粒转染和化合物干预相结合的方法 外源基因表达方法使用的基本方法是质粒载体，因为与线性DNA 相比，质粒载体不容易受到外核酶的影响。质粒转染的重编程效率与病毒载体相比虽然效率偏低，但因其可控成本及安全性，非染色体质粒携带的重编程因子获得非整合iPSCs 的方法逐渐被广泛使用。在此基础上，进一步发现使用小分子化合物不仅可以降低致瘤风险，而且可以提高其重编程效率。

CHENG 等[18]用含OCT4、SOX2、KLF4、SV40LT、c-MYC及LIN28基因的pEP4-EO2S-ET2K 和pEP4-M2L 质粒电穿孔尿液细胞，进一步用含4 种小分子化合物的N2B27 培养基进行培养，结果在10 d 左右就成功培养出iPSCs，其重编程效率可达每孔80 个克隆。WANG 等[19]通过筛选多种重组质粒组合和多种化合物，最终确定低风险因子和小分子化合物，建立了一个高效的外泌体系统，即6F/BM1-4C 系统，该系统因缺乏人类尿源性细胞重编程的致瘤因子，从而可降低致瘤风险，证实6F/BM1-4C 系统在细胞遗传学水平上较为稳定，具有潜在的临床应用价值。LI 等[20]进一步研究如何提高尿液细胞的重编程效率，在质粒电转染的基础上，加入6 种小分子化合物，同时发现用自体喂养替代基质胶可以克服重编程过程中出现的大量细胞死亡所导致的重编程失败，此方法进一步提高尿液细胞的重编程效率，为成功培养iPSCs 提供便利。

1.2.2 仙台病毒载体转染 由于转基因随机地整合到宿主基因组中，并导致转基因重新激活或突变，因此存在一定的风险性。仙台病毒的重要特征在于其能够在细胞质中完全复制，且无法进入受感染细胞的细胞核[21]，因此消除了通过表观遗传修饰改变宿主基因组和基因沉默的风险[22]。仙台病毒能够以非整合形式感染多种细胞类型，且在转导后24 h 内具有高的转导效率和快速的表达能力[23-24]，因此常被用于细胞的有效重编程。

表1 利用质粒电穿孔转染结合化合物干预将尿液细胞重编程为iPSCs

AFZAL 等[25]在将肌营养不良患者尿液细胞重编程为iPSCs 的过程中，提出一种非整合仙台病毒载体的重编程方式，将OSKM 转录因子导入患者的尿液细胞中。该方案在2～3 周内生成完全重编程的克隆。后来，随着技术的进步，研制出了iPSCs 仙台重编程试剂盒，LIN等[26]用该试剂盒也成功地将尿液细胞诱导成iPSCs。SAUER 等[27]在将人尿上皮细胞重编程为iPSCs 并分化为肝细胞的研究中，分别采用了仙台病毒转染和质粒转染两种方法，前者是用表达重组因子hOCT3/4、hSSOX2、hKLF4及hcMYC的重组仙台病毒感染第2 代尿路上皮细胞，后者是用1 组3 个oriP/ebna Epposal 质粒转染尿路上皮细胞，通过核转染其表达重组因子OCT4、SOX2、KLF4、L-MYC、LINL28及抗p53的shRNA，两种方法都可提供令人满意的重编程效率。然而，当比较来自同一供体的尿细胞时，基于仙台病毒的方法获得的菌落和重编程效率均高于基于质粒转染的方法。由此推断来自同一供体的尿液细胞，基于仙台病毒的重编程方法更有效。

1.2.3 mRNA 重编程 在克服iPSCs 重编程风险和低效率的障碍中，mRNA 重编程技术因其矢量清晰的暂态特性，对重编程因子给药、化学计量和时间的灵活控制，以及其衍生iPSCs 生成的速度和效率的优越性，可能成为产生多能干细胞的最有希望的方法之一[15]。

GAIGNERIE 等[28]在寻求将mRNA 重编程应用于最易获得、可选择的细胞类型的研究中，采用含38% OCT4，11.4% SOX2，12.7% KLF4，10.1% LIN28，12.7% MYC，10.1% Nanog，5.1% nGFP 的mRNA 重编程方案对成纤维细胞、牙髓细胞、尿液细胞进行重编程，11 d 后观察以上3 种细胞分别出现21 个、140 个、4 个hiPSCs 克隆，但尿液细胞来源iPSCs 是最早出现。尿液细胞是一个异质的群体，从多个尿源性细胞系中分离得到iPSCs 克隆证实没有出现基因组异常，表明这种重编程的稳定性。后期通过重复和优化证实了mRNA 重编程可以用于包括尿液细胞在内的多种易获得的细胞类型，并且在4 个不同的患者细胞系上是可重复的。

2 人尿源性iPSCs 在遗传病细胞模型中的应用

遗传病患者自身来源的iPSCs 可以提供包含遗传背景在内的特定细胞模型，发挥通过比较遗传背景中的表型来检测病理表型中的突变的特异性作用，拓展个性化药物筛选，同时也逐渐实现了基因的原位转化，促进了精确化治疗的发展。

2.1 在心脏相关遗传病中的应用

之前由于人心肌细胞的来源极其有限，人类遗传性心脏疾病主要在独立于患者的“遗传背景”的异源系统或动物模型中进行了研究。自从尿源性iPSCs 的出现，人们一直致力于利用iPSCs 细胞进行心脏相关遗传病的疾病机制研究和心脏修复，目前逐渐探索尿源性iPSCs 衍生的心肌细胞携带的遗传物质及基因突变特征与患者病理特征的关系，以及利用诱导而来的心肌细胞的自发收缩功能进行药物的高通量筛选。

JOUNI 等[29]将尿源性诱导多能干细胞分化为心肌细胞（UhiPS-CMs），用UhiPS-CMs 来模拟和表征2 型长QT 综合征的分子表型，结果发现A561P KCNH2 突变导致人CMS 中HERG 通道的转运缺陷，从而增加了心律失常的易感性。CAO 等[30]成功地用仙台病毒载体从一位患有心力衰竭的室间隔缺损（VSD）患者的尿液样本中获得了非整合型UiPSCs，该患者的RyR2基因存在L2483R 突变。进一步通过小分子调控Wnt 信号将UiPSCs 快速有效地分化为功能性心肌细胞，经基因检测证明该来源的心肌细胞携带遗传基因突变并具有与患者病理有关的特征，从而加快iPSCs 向高通量筛选应用或再生治疗的转化。MLEE 等[31]在唐氏综合征的研究中，通过电穿孔获得的尿源性T21-iPSCs，经荧光原位杂交验证和光谱核型分析后，证明T21-iPSCs可以维持其细胞遗传的完整性，促进了对T21 表型系统特征相关的研究。在此基础上，进一步利用胰岛素剥夺法[32]成功地将T21-iPSCs 分化为心肌细胞，这些分化的心肌细胞在功能上表现为自发收缩，对β 肾上腺素能激动剂异丙肾上腺素敏感，为高通量筛选改善唐氏综合征患者生活质量的潜在药物奠定了基础。

2.2 在肌营养不良相关遗传病中的应用

肌强直性营养不良（myotonic dystrophy, DM）是一种常染色体显性核苷酸重复扩张障碍，伴有骨骼肌强直、无力，以及心律失常、心力衰竭[33]。根据遗传病疾病特征，利用iPSCs 衍生出的具有相关疾病表型的心肌细胞，通过观察RNA 表达情况、心肌细胞的肌纤维收缩张力、Ca2+瞬时表达来揭示遗传病的基因调控差异和不同类型的病理特征差异。

KIM 等[34]在肌强直性营养不良机制的研究中，利用质粒电穿孔的方法从健康对照组、DM1 和DM2受试者中诱导出多能干细胞（iPSCs），并将其分化为心肌细胞。利用高分辨率成像证明来自DM1 而不是DM2 的iPSCs 来源的心肌细胞存在已知靶基因和MBNL 的异常剪接，同时DM1和DM2 iPSCs 衍生心肌细胞的Ca2+瞬时表达不同，RNA 序列显示两者的基因表达有明显的失调，也存在差异的异常剪接模式。以上研究结果表明DM1 和DM2 尽管有一些共同的临床和分子特征，但有不同的病理特征。PIONER 等[35]在探索肌营养不良蛋白在心肌细胞发育和Duchenne型肌营养不良心肌病早期发展中的作用的研究中，分别从正常健康人和Duchenne 型肌营养不良患者尿液中获得诱导多能干细胞分化的人心肌细胞（hiPSCCMs），将通过CRISPR 技术从健康人中获得的肌营养不良蛋白缺乏的模型与从患者诱导的hiPSCCMs 做对比，结果发现缺乏Dp427 会导致肌纤维收缩张力降低、松弛动力学较慢以及Ca2+处理异常，这与Duchenne 型肌营养不良细胞相似，表明缺乏Dp427 与心肌细胞结构成熟延迟或改变有关联性，该研究为探索Dp427 缺陷对心肌细胞发育早期的功能影响提供了新的见解。GUAN 等[8]通过对Duchenne 型肌营养不良症患者的尿液细胞重编程，进一步诱导分化成心肌细胞，结果证明Duchenne型肌营养不良患者来源的心肌细胞保留了该类患者的肌营养不良蛋白突变，从而促进对该遗传病的机制研究和药物开发。

2.3 在其他遗传病中的应用

随着尿源性iPSCs 技术的成熟，其定向诱导的细胞种类逐渐增多，在遗传病中的应用范围越来越广，不仅为以个性化方式研究遗传病机制提供了一种有效的工具，同时促进了精确治疗的发展。

2.3.1 脊髓型肌萎缩 脊髓性肌萎缩是一种以脊髓进行性运动神经元丢失为特征的神经肌肉疾病，是由存活运动神经元1（SMN1）基因的突变引起的，几乎所有脊髓性肌萎缩患者存在一个类似SMN1 的基因，即存活运动神经元2（SMN2）[36-37]。ZHOU等[38]在脊髓肌萎缩症的研究中，利用iPSCs 重组载体从脊髓性肌萎缩患者的尿液细胞中生成无c-Myc的、非整合的iPSCs,利用CRISPR/Cpf 1 和单链寡核苷酸（ssODN），在SMA-iPSCs 中实现了SMN2基因向SMN1基因的原位转化，效率为4/36。基因转化的iPSCs 株系不含外源序列，并保留正常的核型。值得注意的是，在基因转换的iPSCs 及其衍生运动神经元（iMNs）中有SMN 和基因定位的表达，这是人类细胞中Cpf 1 同源定向修复（HDR）介导的基因转换的首次报道，为大多数脊髓性肌萎缩患者提供了一种通用的基因治疗方法。

2.3.2 遗传性肝病 肝细胞极性对于胆管的发育和肝内胆汁及废物的安全运输至关重要，在与肝细胞极性相关的遗传性肝病研究中，OVEREEM 等[39]利用慢病毒载体的方法将1 例ATP7B 纯合子突变和一例杂合子突变患者的尿液细胞重编程为iPSCs，并将其分化为肝细胞样细胞（hiHpes），利用HiHeps 重述极化蛋白的转运过程，以Cu2+诱导的铜转运蛋白ATP 7B 再分布到胆管结构域为例，结果证明最常见但又令人费解的Wilson 病导致的ATP 7B-h1069q 突变本身并不能阻止将ATP7B 转运到跨高尔基网，相反，其阻止了Cu2+诱导的极化再分布到胆管区，不能被药物折叠伴随分子逆转，该研究表明功能细胞极性可在患者多能干细胞来源的hiHeps 中实现，首次实现了对内源性突变蛋白、患者特异性发病机制和药物反应的研究。

2.3.3 血友病 血友病A 是由于缺乏凝血因子VIII（FVIII）而引起的单基因疾病，这种缺乏症可能导致自发性关节出血或危及生命的出血，但无法治愈[40]。PANG 等[41]从重度血友病A 患者中获得尿源性诱导多能干细胞（iPSCs），并利用转录激活剂样效应因子镍酶将第Ⅷ因子基因（F8）定位于HAiPSCs 中的多倍核糖体DNA（rDNA）位点，旨在解决FVIII 蛋白短缺的问题，结果表明外源F8 的多个拷贝可整合到rDNA 位点上，同时检测到外源性F8 mRNA 和FVⅢ蛋白在靶向HA-iPSCs 中的表达，而且该来源的iPSCs 分化为内皮细胞（ECs）后，仍可检测到外源性FVⅢ蛋白。结果表明，多拷贝rDNA位点可作为iPSCs 基因治疗的有效靶点，这种策略为血友病A 和其他单基因疾病提供了一种新的基于iPSCs 的治疗方案。

3 总结与展望

尿液细胞与其他iPSCs 重编程来源相比具有非侵入性、取材简单、成本低、重编程效率高等优势，iPSCs 重编程技术由最初的存在致瘤风险的慢病毒、逆转录转导技术，逐渐优化为质粒、仙台病毒、mRNA 等介导的非整合技术，同时促进重编程效率、降低风险的小分子化合物也逐渐被发现。随着iPSCs重编程技术的成熟，其被定向分化的细胞种类逐渐在扩展。尿源性iPSCs 及其诱导分化而来的特定细胞因具备患者本身的遗传特征，为遗传病的机制探索、药物筛选、基因治疗提供了很好的研究模型。

目前，尿源性iPSCs 在遗传病方面的应用范围逐渐扩大。遗传性心脏病、室间隔缺损等心脏相关性遗传病的研究，证实了尿源性iPSCs 衍生的心肌细胞携带的遗传物质及基因突变特征与患者病理特征的一致性，并且其表现出自发收缩的心肌功能为药物的高通量筛选提供了可能。在肌强直性营养不良相关遗传病方面，由尿源性iPSCs 衍生的心肌细胞进一步实现了通过观察RNA 表达情况、心肌细胞的肌纤维收缩张力、Ca2+瞬时表达差异来揭示遗传病的基因调控差异和不同类型间的病理特征。另外，在脊髓性肌萎缩、遗传性肝病、血友病等相关遗传病中，由尿源性iPSCs 衍生的细胞模型也逐渐实现了基因的原位转化，促进了精确化治疗的发展。

尿源性iPSCs 在遗传病的研究上有很大的优势，其衍生而来的心肌细胞、肝细胞样细胞或其他细胞为遗传病机制研究、药物筛选、细胞治疗提供了很好的模型。当然，未来还需在某些地方进一步提高，例如尿源性iPSCs 的重编程效率仍需进一步提高。同时，经iPSCs 诱导分化而来的细胞与自身原系统细胞相比，由于缺乏整体的机制系统，不能提供完全整合的视觉，这是未来需要继续突破的地方。希望以后随着高通量测序、基因编辑技术和小分子筛选技术的突破，尿源性iPSCs 与这些技术相结合，进一步开发遗传病的治疗干预技术，为遗传病患者的诊治带来新的希望。