血清长链非编码RNA Rpph1表达对2型糖尿病患者蛋白尿进展的预测价值研究

吴翔，毛盛程，陈浪

（浙江省立同德医院 内分泌科，浙江 杭州310012）

2 型糖尿病近年在我国的发病率逐步升高，随病情加重产生各种急慢性并发症，严重影响患者的生活质量，甚至威胁生命。糖尿病肾病（diabetic nephropathy,DN）是最为常见的糖尿病微小血管并发症，是终末期肾病的主要病因之一。该病存在复杂的代谢紊乱，且一旦进展至终末期肾病，其治疗比其他肾脏疾病更棘手[1-3]。早期预防DN 的发生及延缓其进展具有重要的临床意义。长链非编码RNA（long noncoding RNA, lncRNA）缺乏编码蛋白质的能力，被发现影响多种疾病的发生、发展。其中，lncRNA Rpph1 被发现可影响高糖培养的肾小球系膜细胞炎症因子表达[4]，推测其参与慢性肾病的炎症过程。目前关于lncRNA Rpph1 与DN 内在联系的研究较少，本研究以此为切入点探讨lncRNA Rpph1 对DN 病情进展的影响，旨在进一步研究DN的发病机制，为后续治疗提供新思路。

1 资料与方法

1.1 研究对象

本研究为前瞻性研究。选取2016年1月—2018年1月浙江省立同德医院内分泌科因控制血糖重复住院治疗的2 型糖尿病患者268 例为研究对象。纳入标准：①明确的2 型糖尿病史；②首次及第2 次住院治疗的时间间隔2～4年；③首次住院时留取血清样本；④首次住院时临床资料完整。排除标准：①合并1 型糖尿病或其他类型糖尿病；②合并糖尿病酮症酸中毒或其他严重糖尿病合并症；③合并甲状腺功能异常、垂体瘤、嗜铬细胞瘤等其他内分泌疾病；④合并急慢性基础肾脏疾病；⑤合并恶性肿瘤；⑥入院前2 个月内有激素、利尿剂应用史。

1.2 方法

1.2.1 收集所有患者首次入院的临床资料 性别、年龄、体质量指数（BMI）、糖尿病家族史、糖尿病病程、吸烟、饮酒、合并症、用药情况、空腹血糖（FBG）、糖化血红蛋白（HbA1c）、总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、 血肌酐（Scr）、 尿素氮（BUN）、血尿酸。

1.2.2 24 h 尿蛋白检测及分组 微量蛋白尿是诊断DN 的标志，指尿蛋白定量为30～300 mg/24 h。本研究通过24 h 尿蛋白检测，定义24 h 尿蛋白定量＜30 mg 为无蛋白尿，24 h 尿蛋白定量≥30 mg 但＜300 mg 为微量蛋白尿，24 h 尿蛋白定量≥300 mg 为大量蛋白尿。检测所有患者首次、再次入院的尿蛋白定量。同一患者再次入院后，由之前的无蛋白尿进展至微量蛋白尿，或者由微量蛋白尿进展至大量蛋白尿，或者大量蛋白尿患者Scr 水平翻倍为蛋白尿进展。以此为分组依据将患者分为蛋白尿进展组（n=62）和蛋白尿非进展组（n=206）。

1.2.3 实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测血清lncRNA Rpph1 mRNA 相对表达量 留取初次入院患者的空腹外周静脉血标本5 mL，4℃下静置30 min，室温下3 000 r/min 离心15 min，取上清液冷冻保存于-80℃冰箱。Trizol（购自上海百蕊生物科技有限公司）提取血清样本中的总RNA，参照AMV 逆转录试剂盒（购自上海索宝生物科技有限公司）说明书将其逆转录为cDNA，以cDNA 为模板，采用2×SYBR Green PCR Master Mix 进行qRT-PCR，qRT-PCR 试剂盒购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司。以P53为内参。引物序列检测及合成由生工生物工程（上海）有限公司完成。lncRNA Rpph1 引物：正向5'-TTCGAACGATGATCGATGA-3'，反向5'-CTGAAGCTAAGCTGAGTCG-3'；P53 引 物：正 向5'-AGCTTGTCAGAACGTAGCT-3'，反向5'-CTTGAA CGTTAGCGATAG-3'。反应体系：cDNA 2 μL、2×SYBR Green PCR Master Mix 10 μL、正反向引物各0.6 μL、去离子水补足至20 μL。反应条件：95℃变性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40 个循环。采用2-ΔΔCt法计算lncRNA Rpph1 mRNA 相对表达量，实验进行3 次，取平均值。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 21.0 统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用t检验；计数资料以构成比或率（%）表示，比较用χ2检验；绘制ROC 曲线；影响因素的分析采用多因素Logistic 回归模型。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者首次入院的临床资料比较

两组患者首次入院的糖尿病病程、合并高血压、使用二甲双胍、Scr、血尿酸、lncRNA Rpph1 mRNA 相对表达量比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。两组患者首次入院的性别、年龄、BMI、糖尿病家族史、吸烟、饮酒、合并冠心病、使用血管紧张素转化酶抑制剂（ACEI）/血管紧张素受体拮抗剂（ARB）、使用胰岛素、使用他汀类药物、FBG、HbA1c、TC、TG、LDL-C、HDL-C、BUN 比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 两组患者首次入院的临床资料的比较

2.2 蛋白尿进展的影响因素分析

以再次入院后蛋白尿进展为因变量（0=非蛋白尿进展，1=蛋白尿进展），将首次入院的临床资料单因素分析中有统计学意义的指标（糖尿病病程、合并高血压、使用二甲双胍、Scr、血尿酸、lncRNA Rpph1 mRNA 相对表达量）为自变量，纳入Logistic 回归模型，结果：合并高血压[=3.271（95% CI：1.864，3.872）]、使用二甲双胍[=2.192（95% CI：1.253，2.413）]、Scr 水 平[=1.873（95% CI：1.211，2.063）]、血 酸水平[=2.321（95% CI：1.432，2.784）]、lncRNA Rpph1 mRNA 相对表达量[=2.621（95% CI：1.732，3.064）]是2 型糖尿病患者蛋白尿进展的独立危险因素（P＜0.05）。见表2。

表2 白蛋白尿进展影响因素的多因素Logistic回归分析参数

2.3 血清lncRNA Rpph1 mRNA 相对表达量对蛋白尿进展的预测价值

首次入院血清lncRNA Rpph1 mRNA 相对表达量预测蛋白尿进展的最佳截断值为0.564，曲线下面积（AUC）为0.800（95% CI：0.742，0.858），敏感性为67.48%（95% CI：0.517，0.784），特异性为82.26%（95%CI：0.684，0.935）。见图1。

图1 血清lncRNA Rpph1 mRNA相对表达量预测蛋白尿进展的ROC曲线

3 讨论

DN 的病因及发病机制尚不明确，可能涉及遗传、肾脏血流动力学异常、高血糖致代谢异常、血管活性物质代谢异常等多因素[5-7]，但部分初始病情相似患者的疾病进展速度存在较大差异，推测存在其他影响疾病进展的因素。DN 患者开始出现蛋白尿并随病情进展尿蛋白定量逐步增加，是病情恶化的重要标志[8-10]。本研究使用Logistic 回归模型分析蛋白尿进展的影响因素发现：合并高血压、使用二甲双胍、Scr 水平、血尿酸水平、lncRNA Rpph1 mRNA 相对表达量高均是2 型糖尿病患者蛋白尿进展的独立危险因素。

高血压是肾病发生的重要促发因素[11-12]；二甲双胍可能增加肾功能不全者乳酸酸中毒的风险[13-14]；Scr 是最为重要的肾功能指标之一，2 型糖尿病患者早期Scr 水平较高提示其肾功能存在潜在损伤，肾脏组织对高血糖带来的一系列代谢紊乱的耐受度较弱[15-17]；血尿酸也在不同研究中被证实是DN 进展的重要因素之一，可能与高尿酸血症加速肾血管内皮功能紊乱、促进肾脏炎症反应等机制相关[18-20]。

既往研发现lncRNA Rpph1 可诱导神经元损伤[21]；且可促进外泌体介导的巨噬细胞M2 极化，促进结直肠癌转移[22]，但关于lncRNA Rpph1 与糖尿病及DN 的研究较少。本研究结果发现，血清lncRNA Rpph1 mRNA 相对表达量较高与DN 患者蛋白尿进展密切相关，这是继张攀扬等[4]的研究后，再次明确了lncRNA Rpph1 高表达对DN 病情进展的意义。ZHANG 等[23]研究指出，在7 个与DN 相关的lncRNAs 中发现lncRNA Rpph1 表达显著升高，且在高糖状态下可通过Gal-3/Mek/Erk 信号通路促进系膜细胞的增殖和炎症反应下调lncRNA Rpph1 表达，提示lncRNA Rpph1 通过Gal-3/Mek/Erk 信号通路影响DN 的肾脏炎症反应。DN 的病情进展与炎症密切相关，肖瑛等[24]也证实抑制炎症反应可减轻DN 大鼠的肾组织纤维化。有研究[25]报道，lncRNA Rpph1激活肾脏炎症反应的作用可能是其成为DN 病情近期进展的重要原因，但具体机制有待进一步研究。

lncRNA Rpph1 的表达变化在DN 蛋白尿进展中起重要作用，本研究进一步探讨其对蛋白尿进展的预测价值。ROC 曲线分析发现：首次入院血清lncRNA Rpph1 mRNA 相对表达量预测蛋白尿进展的最佳截断值为0.564，AUC 为0.800，敏感性为67.48%，特异性为82.26%。以上结果提示，早期血清lncRNA Rpph1 mRNA 相对表达量检测对后续DN 患者蛋白尿进展具有预测价值，可能成为后续DN 患者病情进展风险筛查、针对性干预措施制订的参考指标。

综上所述，血清lncRNA Rpph1 mRNA 相对表达量是2 型糖尿病患者蛋白尿进展的独立危险因素之一，其对蛋白尿进展具有预测价值。