薏苡仁提取物对糖尿病肾病大鼠肾功能的作用及机制研究

彭湘，陈丽，薛琳

（攀枝花市中心医院 肾病内科，四川 攀枝花617067）

糖尿病肾病是糖尿病的常见并发症之一，也是终末期肾病的主要原因[1]。临床以早期肾小球、肾小管肥大，晚期肾小球硬化、纤维化等复杂的结构改变为特点[2]。肾脏的氧化应激、炎症反应及代谢异常是肾功能恶化的主要原因[3]。肾脏活性氧过多和代谢异常会导致细胞蛋白激酶C 亚型活化[4]，以及细胞核因子-κB（NF-κB）和转化生长因子-β1（TGF-β1）过度表达，这些异常的炎症反应最终导致肾小球硬化和肾间质纤维化[5]。TGF-β1作为一种与肾纤维化密切相关的细胞因子，可激活肾小管上皮细胞蛋白激酶C 和上皮间质转化，最终导致肾间质纤维化[6]。Toll 样受体在肾炎的发生、发展中也起着重要作用[7]。Toll 样受体可通过激活NF-κB和髓样分化因子88（myeloid differentiation factor, MyD88）产生炎症细胞因子，包括IL-8、IL-6等[8]，在这个过程中，MyD88 起到了肾脏炎症的放大作用[9]。薏苡仁提取物（Coix seed extract, CES）为禾本科植物薏苡的干燥成熟种仁提取物，可有效促进新陈代谢，具有促进体内血液和水分的新陈代谢、利尿、消水肿等作用[10]。药理研究表明，CSE 对2 型糖尿病大鼠具有抗氧化和降血糖的生物活性。同时，还有利于糖尿病肾病的肾脏修复，其生物活性与其调节血糖、血脂水平及改善肾功能有关[11]。本研究通过复制糖尿病肾病大鼠模型，探讨CSE 保护糖尿病肾病大鼠肾脏功能的作用及相关机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物、材料与试剂

本研究根据国家科学技术委员会颁布的《实验动物管理条例》进行。50 只雄性SPF 级Wistar 大鼠购自浙江省农业科学院[生产许可证：SCXK（浙）2017-0001]。薏苡仁标本由海南医学院田建平教授惠赠。兔抗鼠一抗TGF-β1购自英国Abcam 公司，兔抗鼠一抗MyD88 购自美国BioWorld 公司，山羊抗兔二抗IgG 购自英国Abcam 公司。

1.2 CSE的制备

用95%乙醇回流提取1.2 kg 干粉和磨碎的薏苡仁浸膏2 h，将浸出物合并在旋转蒸发器中浓缩，再将提取物在80℃真空干燥炉中干燥，获得102.3 g的薏苡仁提取物，4℃的冰箱中保存供实验使用。

1.3 实验方法

大鼠饲养环境室温（23±2）℃，相对湿度50%～60%，光照条件：12 h 昼/夜循环照明。采用单次腹腔注射50 mg/kg 链脲佐菌素（STZ）复制糖尿病大鼠模型，注射3 d 后，从大鼠尾静脉采集血样，检测血糖水平。血糖＞250 mg/dL（13.88 mmol/L）的大鼠被认为是糖尿病模型复制成功。以10 只正常大鼠作为对照组（ND 组），剩余40 只糖尿病大鼠随机分为4 组：糖尿病组（STZ 组）、格列齐特组（GLI 组）、CSE 低剂量组（CSE-L 组） 及高剂量组（CSE-H组），每组各10 只。STZ 组模型复制后给予等量蒸馏水灌胃；GLI 组给予5 mg/kg 格列齐特灌胃；CSE-L组给予400 mg/kg 的CSE 灌胃；CSE-H 组给予800 mg/kg 的CSE 灌胃。将CSE 溶于10%吐温80溶液中，据预实验结果设定400 mg/kg 的CSE-L 组和800 mg/kg 的CSE-H 组，这两个剂量是中药药效学研究中常用的剂量。所有治疗间隔时间为3 d/次，干预6 周。实验期间所有动物均可自由进食标准大鼠饲料。6 周末将所有大鼠放入代谢笼中进行24 h 尿液采集。所有动物称重后麻醉，经股动脉采集血标本，颈椎脱臼处死大鼠。取右肾称重，用冷等渗盐水冲洗，置入-80℃冰箱冷冻保存，进行生化检测和Western blotting 分析，左肾置于10%甲醇固定，用做组织学检查。

1.4 肾脏组织学检查

处死大鼠后，完整取出肾脏并称重。肾组织用4%多聚甲醛溶液固定，石蜡包埋，制成4 μm 切片。烤片，冷却后低温冻存。经二甲苯脱蜡，乙醇梯度水化。苏木精染色30～60 s，冲洗5 min，伊红染色30 s，冲洗5 min；乙醇梯度脱水，干燥，二甲苯透明，中性树胶封固，晾干，光学显微镜下观察。

1.5 24 h尿蛋白和血液生化指标的检测

6 周末时，取每只大鼠24 h 尿液，3 000 r/min离心5 min，采用南京建成生物工程研究所试剂盒对尿蛋白进行测定。于1 周、3 周、6 周时取大鼠尾静脉血，用1906-05 血糖仪检测空腹血糖水平。血样在4℃、7 000 r/min 离心10 min，获取血浆样本。血清肌酐（Scr）、血尿素氮（BUN）、甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、谷胱甘肽（GSH）检测采用南京建成生物工程研究所试剂盒。酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒检测大鼠肾组织中白细胞介素-6（IL-6）水平。

1.6 Western blotting检测

肾皮质用RIPA 缓冲液（pH=7.5）溶解。在10%SDS-PAGE 上（100 V，1.5 h）分离等量的蛋白质，在冰冷条件下转移到PVDF 膜上。用5%脱脂乳在含0.1%吐温20 的缓冲液中封闭1 h，并在4℃、兔抗鼠一抗TGF-β1（1∶500 稀释）和兔抗鼠一抗MyD88（1∶500 稀释）中孵育过夜。用含吐温20 的Tris 缓冲液洗涤后，与辣根过氧化物酶（HRD）偶联的山羊抗兔二抗IgG 共同孵育2 h。将膜放置在Bio-Rad Chemi Doc XRS +化学发光凝胶成像系统上，以GAPDH 作为内参。

1.7 统计学方法

数据分析采用SPSS 22.0 软件。计量资料均数±标准差（±s）表示，比较用单因素方差分析或重复测量设计的方差分析，进一步两两比较Dunnet-t检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肾脏组织学检查结果

病理学检查结果显示，ND 组大鼠肾组织形态正常，肾皮质与髓质组织边界清晰。肾小管上皮细胞排列紧密，未见明显炎症反应。STZ 组大鼠肾小管上皮细胞胞浆内可见大量空泡和肿胀，肾小管周围有较多炎症细胞浸润和组织增生。GLI 组、CSE-L 组和CSE-H 组肾小球形态结构正常，肾皮质与髓质组织边界清晰，偶见肾小管上皮细胞胞浆空泡化。见图1。

图1 各组大鼠肾脏组织学检查结果 （苏木精-伊红染色×200）

2.2 各组大鼠不同时间空腹血糖的比较

各组大鼠不同时间空腹血糖水平的比较，经重复测量设计的方差分析，结果：①各组大鼠在1 周、3 周、6 周的空腹血糖水平差异有统计学意义（F=24.768，P=0.000），6 周时的空腹血糖水平低于1 周、3周时的空腹血糖水平（P＜0.05）。②各组大鼠的空腹血糖水平差异有统计学意义（F=14.308，P=0.000），STZ组空腹血糖水平高于ND组（P＜0.05），CSE-L组、CSE-H 组空腹血糖水平低于STZ 组（P＜0.05）。③各组大鼠空腹血糖水平的变化趋势差异有统计学意义（F=32.253，P=0.000）。见表1。

表1 各组大鼠不同时间空腹血糖的比较（n=10，mmol/L，±s）

表1 各组大鼠不同时间空腹血糖的比较（n=10，mmol/L，±s）

组别ND组STZ组GLI组CSE-L组CSE-H组1周6.69±1.12 33.09±0.58 29.56±2.24 30.79±4.31 25.72±2.04 3周6.12±1.18 22.23±4.05 16.71±7.85 14.88±6.67 22.10±5.45 6周5.16±0.86 21.28±5.36 9.91±2.15 9.24±2.78 10.89±6.28

2.3 各组大鼠24 h尿蛋白含量、初始体重、最终体重和肾脏重量的比较

各组大鼠24 h 尿蛋白含量、初始体重、最终体重比较，经单因素方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05），STZ 组24 h 尿蛋白水平高于ND 组（P＜0.05），初始体重、最终体重低于ND 组（P＜0.05），CSE-L 组、CSE-H 组24 h 尿蛋白水平低于STZ 组，初始体重、最终体重高于STZ 组（P＜0.05）。各组大鼠肾脏重量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 各组大鼠24 h尿蛋白含量、初始体重、最终体重和肾脏重量的比较 （n=10，±s）

表2 各组大鼠24 h尿蛋白含量、初始体重、最终体重和肾脏重量的比较 （n=10，±s）

组别ND组STZ组GLI组CSE-L组CSE-H组F 值P 值24 h尿蛋白/（μg/24 h）2 102.0±732.4 3 491.5±1 965.2 241.6±225.8 1 632.5±492.7 1 433.8±433.9 14.300 0.000初始体重/g 238.6±81.8 202.4±18.2 213.6±9.7 203.5±15.4 218.5±8.3 3.340 0.029最终体重/g 384.5±34.2 165.3±20.2 205.7±16.3 209.6±4.2 214.5±7.5 189.900 0.000肾脏重量/g 1.16±1.10 0.92±0.09 1.03±0.07 1.03±0.09 1.04±0.09 0.815 0.521

2.4 各组大鼠肾功能参数的比较

各组大鼠肾功能参数的比较，经单因素方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）。STZ 组Scr、BUN、TC、HDL-C 及IL-6 水平高于ND 组（P＜0.05）；CSE-H组Scr、BUN、TG、TC、HDL-C、GSH 及IL-6 水平低于STZ 组（P＜0.05）。见表3。

表3 各组大鼠肾功能参数的比较 （n=10，±s）

表3 各组大鼠肾功能参数的比较 （n=10，±s）

组别ND组STZ组GLI组CSE-L组CSE-H组F 值P 值Scr/（μmol/L）90.13±4.91 125.43±7.06 112.58±12.39 140.83±8.36 107.87±11.69 9.058 0.000 BUN/（nmol/L）4.61±0.98 13.65±3.55 9.78±2.45 13.05±2.58 9.54±2.39 4.252 0.008 TG/（mmol/L）0.07±0.05 0.20±0.05 0.13±0.08 0.12±0.06 0.08±0.01 3.184 0.024 TC/（mmol/L）1.63±0.30 3.89±0.69 2.25±0.22 2.09±0.43 1.53±0.22 5.644 0.002 HDL-C/（mmol/L）0.59±0.12 1.28±0.18 0.80±0.15 1.07±0.13 0.86±0.09 5.524 0.003 GSH/（μmol/L）21.21±0.38 22.90±1.22 19.08±1.45 21.87±1.78 19.12±1.58 1.264 0.041 IL-6/（μg/mL）44.45±5.12 155.35±36.11 52.26±15.86 93±21.34 72.42±14.45 6.234 0.003

2.5 各组大鼠肾组织中TGF-β1和MyD88 蛋白相对表达量的比较

各组大鼠肾组织中TGF-β1和MyD88 蛋白相对表达量的比较，经单因素方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05），STZ 组肾组织中TGF-β1蛋白相对表达量高于ND 组（P＜0.05），MyD88 蛋白相对表达量低于ND 组（P＜0.05）；CSE-H 组肾组织中TGF-β1蛋白相对表达量低于STZ 组，MyD88 蛋白相对表达量高于STZ 组（P＜0.05）。见表4 和图2。

图2 各组大鼠的TGF-β1和MyD88蛋白相对表达量

表4 各组大鼠肾组织中TGF-β1和MyD88蛋白相对表达量的比较 （n=10，±s）

表4 各组大鼠肾组织中TGF-β1和MyD88蛋白相对表达量的比较 （n=10，±s）

组别ND组STZ组GLI组CSE-L组CSE-H组F 值P 值TGF-β1蛋白0.38±0.12 0.84±0.21 0.42±0.15 0.48±0.18 0.79±0.20 15.436 0.000 MyD88蛋白0.85±0.24 0.61±0.16 1.02±0.12 0.87±0.21 0.63±0.18 12.132 0.000

3 讨论

本研究采用STZ 复制糖尿病肾病模型，观察CSE 对糖尿病大鼠肾脏损伤的保护作用，并通过检测血清中多种生化指标及肾组织中TG-β1和MyD88蛋白的相对表达量，观察其对肾脏的生物学效应。结果发现，与非糖尿病大鼠相比，糖尿病大鼠的空腹血糖水平明显升高，体重明显下降。不同剂量的CSE 干预均能显著降低糖尿病大鼠的血糖和尿蛋白水平，改变Scr、BUN、TG、TC、HDL-C、GSH 及IL-6 水平。以上结果提示，CSE 降血糖的作用可能与其改善糖脂代谢有关。糖脂代谢紊乱可引起肾脏局部血流动力学改变，导致肾间质纤维化和肾小球硬化，发展为糖尿病肾病[12]。之前研究表明，CSE 可调节糖脂代谢异常，预防糖尿病及其并发症的发生[13]。进一步说明其在治疗高脂血症等领域的潜在临床价值。糖尿病肾病的早期症状主要表现为微量白蛋白尿，病理改变主要表现为肾小球肥大、肾小球细胞外基质积聚、基底膜增厚，最后发展为肾小球硬化和纤维化[14]。在临床研究中，糖尿病患者一旦出现持续性蛋白尿症状，将不可避免地进展为终末期肾病[15]。糖尿病肾病已成为糖尿病患者重要的死亡原因，因此，研究糖尿病肾病的发病机制和预防方法具有重要意义[16]。然而，由于糖尿病肾病病因的复杂性，糖尿病肾病发生的分子机制尚不清楚。CES 常被用来治疗消化不良、利尿、炎症和肠道疾病，主要利用其温肾、护精止尿、温脾止泻的作用。另有研究表明，CSE能降低DN 大鼠的血糖，改善肾功能[17]。

预防糖尿病肾病进展是一项具有挑战性的临床目标。细胞因子IL-6 在糖尿病的发病机制中起重要作用[18]。本研究中，糖尿病组大鼠IL-6 水平升高，CSE 治疗6 周后，CSE 组IL-6 水平下降。TGF-β信号通路与机体的各种病理变化密切相关，TGF-β被认为是慢性肾脏病的重要致病因素[19]。TGF-β 水平降低可减少DN 的基质降解，诱导足细胞、肾小管上皮细胞和内皮细胞凋亡[20]。糖尿病肾组织中TGF-β 的表达增加与肾纤维化有关，抑制其表达可减轻糖尿病动物模型的纤维化[21]。本研究发现TGF-β1在糖尿病肾病大鼠肾组织中的表达增加，CSE 800 mg/kg 可明显抑制DN 大鼠肾组织TGF-β1的上调，提示高剂量CSE 可能具有减轻DN 肾纤维化的潜在作用。TLR 介导的信号可诱导多种炎症因子，如IL-1、IL-6、TGF、TNF，从而导致糖尿病肾病大鼠肾小球系膜增生和细胞外基质的产生[22]。MyD88 是Toll 样受体信号通路中的一个关键配体[23]，在传递上游信息和疾病发生、发展中具有重要的作用，本质上是一种胞质可溶性蛋白，其在先天性和适应性免疫应答中起关键作用[24]。同时在白细胞介素和Toll 样受体信号转导通路中起着至关重要的信号转导作用，该途径调节了许多促炎基因的激活[25]。本研究发现，CSE 可提高MyD88 水平，明显改善肾功能，抑制IL-6 的表达，降低血糖水平，减轻肾脏纤维化和炎症，这可能是其减轻肾脏炎症的原因之一[26]。Western blotting 结果显示，CSE激活肾脏中的TGF 和Toll 样受体信号通路。这两条信号通路可减轻肾间质纤维化和肾小管上皮细胞凋亡，从而减少炎症因子的产生，保护肾功能。

综上所述，CSE 可抑制糖尿病肾病大鼠肾脏纤维化进程和炎症反应，具有良好的肾脏保护作用。