类风湿关节炎患者PBMCs 中IL- 27 及Blimp1 mRNA 表达及意义

杨利，尚喜晓，王娟

（1.中原油田医疗卫生服务中心菊园医院大内科，河南 濮阳 457331；2.濮阳市油田总医院放疗科，河南 濮阳 457001；3.濮阳市油田总医院门诊部，河南 濮阳 457001）

类风湿关节炎（Rheumatoid Arthritis,RA）是一种以侵蚀性滑膜炎为主要临床特点的自身免疫性疾病，严重者甚至会破环软骨和骨组织[1]。 目前RA的具体发生机制仍不完全清楚，与自身免疫功能、遗传、环境等多种因素有关[2]。 滑膜炎的发生与患者体内促炎细胞因子水平升高密切相关。 IL-27 属新型的炎性细胞因子[3,4]，近年来研究发现在许多肿瘤，感染性、自身免疫性疾病中白细胞介素-27（Interleukin-27,IL-27）起着重要作用，B 淋巴细胞诱导的成熟蛋白1（B Lymphocyte Induced Maturation Protein 1,Blimp1）在B 细胞分化为浆细胞和浆细胞以分泌高水平的免疫球蛋白中起着关键的转录调节作用[5]，与免疫系统疾病密切相关，但是关于RA患者中Blimp1 和IL-27 的水平变化的报道很少。本研究目的是观察RA 患者外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cell,PBMC）中IL-27和Blimp1 mRNA 水平的变化及其临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2018年1月至2019年3月中原油田医疗卫生服务中心菊园医院治疗的RA患者110 例为观察组，纳入标准：⑴诊断符合美国风湿病学会（ACR）2009年修订RA 分类标准；⑵近6 个月未接受过激素或免疫治疗； ⑶患者及家属知情同意。 排除标准：⑴妊娠期或哺乳期妇女；⑵有混合结缔组织病、系统性红斑狼疮；⑶合并有恶性肿瘤、肝肾功能障碍、甲状腺疾病等。 同时选取健康志愿者100 例作为对照组，观察组和对照组一般资料比较见表1。

表1 观察组和对照组一般资料比较

1.2 检测方法

1.2.1 荧光定量PCR 检测两组患者外周单个核细胞Blimp1 mRNA 水平 采集空腹静脉血4ml，采用密度梯度离心法应用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞，采用Trol 法提取总RNA，用核酸蛋白分析仪进行检测，A260/280 值在1.8 ～2.0 之间，纯度符合反转录要求；逆转录合成cDNA；实时荧光定量PCR 反应：BLIMP1, 上游引物序列：5’-ACACACGGGAGAAAAGCCA-3’，下游引物序列：5’-CTTGTGGCACTGGGAGCAC- 3’，内参为GAPDH，上游引物序列：5’ - CATCAAGAAGGTGGTGAAGCAG-3’, 下游引物序列：5’- CAAAGGTGGAGGAGTGGGTG – 3’，SYBR 反应体系共20μl：cDNA2μl，上下游引物各1μl，Tap 酶混合物10μl，无RNA 酶水6μl。反应条件为：95 ℃10 min，95 ℃15s，59 ℃1min，40 个循环。 相对表达量依据2-ΔΔCt计算，每组重复3 次取平均值。

1.2.2 ELISA 法检测血浆IL-21 水平 采集空腹静脉血2ml，离心分析血浆，采用ELISA 法检测血浆IL-21 水平，检测仪器为ELX800 型酶标仪（美国宝特公司），试剂盒购自南京建成生物工程研究所，严格按照试剂和仪器使用说明书进行操作。

1.3 RA 活动度判断标准 疾病活动判断采用RA疾病活动度评分28（DAS28）进行评价[7],其中DA S28 积分＜3.2 分为低缓组，DAS28 积分3.2～5.1 分为中度活动组，DAS28 积分＞5.1 分为高度活动组。1.4 统计学处理 数据分析采用SPSS22.0 软件，IL-27 及Blimp1 mRNA 等资料采用均数±标准差表示，两组间比较使用t 检验，多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t 检验。 性别差异比较使用卡方检验。 相关性采用Pearson 相关分析。 检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 观察组和对照组PBMCs 中IL-27 及Blimp1 mRNA 表达 观察组和对照组PBMCs 中IL-27、Blimp1 mRNA 相对表达量明显高于对照组（P＞0.05），见表2。

表2 观察组和对照组PBMCs 中IL- 27 及Blimp1 mRNA 表达

2.2 观察组不同疾病活动患者PBMCs 中IL-27 及Blimp1 mRNA 表达 高度活动组PBMCs 中IL-27、Blimp1 mRNA 相对表达量明显高于低缓组和中度活动组（P＞0.05）； 中度活动组PBMCs 中IL-27、Blimp1 mRNA 相对表达量明显高于低缓组（P＞0.05）；见表3。

表3 观察组不同疾病活动患者PBMCs中IL- 27 及Blimp1 mRNA 表达

2.3 相关性分析 将观察组PBMCs 中IL -27、Blimp1 mRNA 相对表达量与DAS28 积分进行相关分析，结果显示：IL-27、Blimp1 mRNA 相对表达量与DAS28 积分呈正相关（r=0.246 和0.359，P＜0.05），见图1。

图1 相关分析图

3 讨论

RA 的发病机制目前尚不明确，但近年来RA的发病率和死亡率呈现上升趋势，是影响我国居民健康和生活质量的常见慢性病。 RA 以不可逆的骨及关节破坏为主要临床表现，且病情反复加重，迁延不愈，最终引起骨关节的变性和功能障碍[8]。在RA 的发病过程中，骨及关节的通常以非细菌性炎性损害为主，在其发病及进展过程中，炎性细胞因子发挥着重要的作用，诸如肿瘤坏死因子、白细胞介素等，均参与RA 的发病及病理改变的发生过程。

研究发现RA 的发生与T 淋巴细胞和B 淋巴细胞均有关，B 淋巴细胞可通过抗原递送, 细胞因子的分泌和自身抗体的产生来促进RA。 细胞因子在淋巴细胞活化和细胞间信号传导中起重要作用，并参与RA 患者的滑膜炎症过程[9],IL-27 是IL-12 超家族成员中的一员，参与自身免疫性疾病中的炎症反应，IL-27 具有免疫抑制和免疫促进的双重特征。 IL-27 衍生自具有不同来源和功能的不同细胞，目前认为IL-27 主要由抗原呈递细胞（AntigenPresenting Cell,APC）、单核细胞、巨噬细胞等分泌[10]。 IL-27 与IL-27 受体复合物结合时才具有生物活性，Blimp1 基因位于人6 号染色体q21-q22中，在B 细胞分化为浆细胞中起着非常重要的作用，Blimp1 转录调节免疫球蛋白的B 淋巴细胞分化和浆细胞分泌[11]，但关于其对自身免疫的研究很少。

本研究结果显示，观察组PBMCs 中IL-27 相对表达量分别高于对照组。 IL-27 主要由滤泡辅助T 细胞、Th17 细胞及NKT细胞等CD4+T 细胞分泌，通过和IL-27R 结合发挥相应生物学作用。 有报道称[12,13]IL-27 可以使RA 患者的CD4+T 细胞和促炎性细胞因子发生活化，促使RA 患者生成破骨细胞。 进而参与骨质破坏以及诱导滑膜释放基质金属蛋白酶参与关节病变。 在T 细胞分化的早期，IL-27 可以促进CD4+T 细胞向Thl 细胞分化，同时协同IL-12 促使T 细胞产生IFN-γ，诱导Thl 细胞的促炎性作用。 有研究显示，IL-27 在免疫抑制中担当了重要的角色，主要表现在Th17 细胞及其相关因子的抑制方面。 而已有实验表明Th17 细胞及其相关细胞因子参与了类风湿性关节炎的发病，由此可见，IL-27 也可能与RA 的发病有关。 赵芬等[14]通过RA 模型发现阻断IL-27/IL-27R 通路能够改善RA 病情。 IL-27 可促使RA 患者滑膜细胞产生TNF-α、IL-6 ，因此阻断IL-27 有望成为治疗RA 的有效途径。

Blimp1 具有调节B 淋巴细胞分化的作用，RA是一种自身免疫性疾病，RA 发生时B 淋巴细胞会发生异常变化[15]，例如类风湿因子和抗CCP 抗体异常升高，目前，很少有学者研究类风湿关节炎患者中Blimp1 的表达和IL-21 的调节情况。 本研究结果表明，RA 患者PBMCs 中Blimp1 mRNA 相对表达量高于对照组，表明RA 患者PBMCs 中Blimp1 mRNA 表达上调，可能是由于B 细胞的增殖、分化，浆细胞特异表达抗原比例增加，标记的浆细胞数增多，而Blimp1 于B 细胞向浆细胞分化过程有关，因此提示Blimp1 高表达促进了自身免疫疾病的发生，可能与类风湿的发病相关。

结果显示： 随着RA 病情的活动，PBMCs 中IL-27、Blimp1 mRNA 相对表达量组间增高，提示RA 活动度大的患者，体内炎症反应及免疫抑制强度越高，浆细胞表达越强烈，Blimp1 mRNA 水平越高，IL-27 可诱导未成熟的T 细胞向Th1 细胞分化，产生Th1 型反应并促进某些炎性因子的产生从而加重RA 炎症反应。 因此PBMCs 中IL-27、Blimp1 mRNA 表达量较活动低度的患者多。 IL-27、Blimp1 mRNA 相对表达量与RA 活动度呈正相关。 而且在相关分析中发现，RA 患者PBMCs 中IL-27、Blimp1 mRNA。

本研究虽然取得了理想的实验结果，但也存在不足之处，本研究纳入病例数较少，且都来自于我院，实验结果可能存在一定程度的偏倚，在今后的研究中需要扩大样本量。

综上所述，类风湿关节炎患者PBMCs 中IL-27 及Blimp1 mRNA 表达明显上调，两者均与疾病活动呈正相关，其可能与RA 的发病与进展有关，可能通过相互调控共同参与RA 的发病及进展过程。