Npas4在小鼠原代神经元体外氧糖剥夺/复氧损伤中的保护作用及其可能机制*

石子璇， 饶 维， 姬广辉， 腰向颖△

（解放军总医院第六医学中心1中医内科，2神经外科，北京100048）

脑卒中是神经系统的常见急重症，其流行率、发病率和死亡率均较高，已成为我国居民的首要死因及成人首要致残原因［1-2］，而缺血性脑卒中在其中占比高达67.3%~80.5%［3］。尽管目前多种再灌注治疗手段（如溶栓、取栓及闭塞再通等）在临床广泛应用，但目前仍缺乏有效的临床干预靶点及神经保护药物［4-5］。神经元PAS结构域蛋白4（neuronal Per-Arnt-Sim domain protein 4，Npas4）是碱性螺旋-环-螺旋转录因子家族中的一员，几乎仅表达于脑组织，参与调节抑制性突触发育及突触可塑性，在学习和记忆中发挥重要作用；同时，Npas4也是一种神经元兴奋相关的即早基因，与多种神经退行性疾病关系密切［5］。部分研究也揭示Npas4可减轻缺血性脑损伤，具有一定的神经保护作用［6］。然而，神经元氧糖剥夺/复氧（oxygen-glucose deprivation/reoxygenation，OGD/R）损伤后，Npas4的表达规律及其具体作用目前尚不清楚。本项工作拟构建小鼠原代皮层神经元OGD/R模型，观察损伤后Npas4的时间变化规律，并通过基因干预下调Npas4的表达，探讨其在神经元OGD/R损伤中的作用及其可能机制。

材料和方法

1 实验材料与主要试剂

C57BL/6孕鼠，孕14~15 d，22~25 g，SPF级，由空军军医大学实验动物中心提供，实验动物合格证编号为SCXK（陕）-2019-001。神经元培养液（Neuro⁃basal®、B27和GlutaMAX™）及Dulbecco改良Eagle培养 液（Dulbecco's modified Eagle medium，DMEM）（Thermo Fisher Scientific）；RNA提取、反转录及实时定量PCR试剂盒（TaKaRa）；细胞计数试剂盒8（Cell Counting Kit-8，CCK-8；上海生工生物工程公司）；Western blot试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；抗Npas4抗体（NeuroMab）；抗Homer1a抗体（Santa Cruz）；抗caspase-3和cleaved caspase-3抗体（Cell Signaling Technology）；无关序列（scramble）及Npas4短发夹RNA（short hairpin RNA，shRNA）慢病毒颗粒（上海吉凯基因化学技术有限公司）。

2 主要方法

2.1 小鼠原代皮层神经元培养 孕14~15 d C57BL/6小鼠予以颈椎脱臼处死，无菌条件下分离胎鼠皮层，置于含有预冷的DMEM中，剪碎后加入0.15%胰蛋白酶37℃孵箱酶解10 min，于DMEM（含10%胎牛血清）中终止酶解，54×g离心5 min，弃上清，重复终止酶解步骤1次，加入DMEM（含10%胎牛血清），轻柔吹打制备单细胞悬液，70µm细胞滤网过滤，接种于100 mg/L多聚赖氨酸包被的培养皿，置于37℃细胞培养箱培养；培养6 h后，更换为Neurobasal完全培养液，置于37℃细胞培养箱继续培养，后每3 d半量换液，培养至第9天待用。

2.2 OGD/R模型制备 选取生长状态良好的成熟原代神经元，更换培养液为无糖Neurobasal培养液，置于缺氧培养箱（氧浓度监测<1%，N∶2CO2=95%∶5%）中培养3 h后更换为Neurobasal完全培养液，正常培养箱（空气∶CO2=95%∶5%）中培养至实验所需时点后，予以下一步处理。

2.3 乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）检测 采用Cytotoxicity Detection Kitplus进行LDH检测，收集培养液上清离心，后取上清液100µL加入96孔板中，加入100µL工作液，震荡后避光孵育30 min，加入50µL终止液，酶标仪（波长490 nm）测定吸光度（A）值，绝对测量值=测量值−空白对照值（正常完全培养液）。神经毒性（%）=（实验组A值−低对照A值）（/高对照A值−低对照A值）×100%。（低对照：未处理组培养液上清液；高对照：未处理组加入酶解溶液后的培养液上清液；实验组：处理组培养液上清液）。

2.4 Npas4-shRNA慢病毒载体的构建及感染Npas4-shRNA（5′-GGTTGACCCTGATAATTTA-3′）及其无关序列（5′-GGTTCAGCGTCATAATTTA-3′）载体构建及慢病毒包裹均委托于上海吉凯基因公司。待神经元培养至第5天，按梯度浓度加入慢病毒颗粒，6~8 h后予以换液，培养至第8天后造模并提取mRNA及蛋白，验证转染效率，选取合适的感染指数，后按此感染指数进行神经元基因干预造模。

2.5 RT-qPCR实验 按照TaKaRa MiniBEST Uni⁃versal RNA Extraction Kit说明书提取RNA，浓度定量后，据说明书进行20µL体系反转录及25µL体系qPCR，待反应结束后，进行mRNA相对表达水平的分析。所使用引物均由TaKaRa合成：Npas4的上游引 物 序 列 为5′-CAGGATGACTCACACTGACAG⁃TATTTTTAG-3′，下游引物序列为5′-GTGGGAGA⁃AGAGCTATTTATATCACCAG-3′；Homer1a的上游引物序列为5′-GGCAAACACTGTTTATGGACTGG-3′，下游引物序列为5′-GTAATTCAGTCAACTTGAG⁃CAACC-3′；GAPDH的上游引物序列为5′-GGGT⁃CAGAAGGATTCCTATG-3′，下 游 引 物 序 列 为5′-GGTCTCAAACATGATCTGGG-3′。

2.6 Western blot检测蛋白表达 使用RIPA裂解液（含1%蛋白酶及磷酸酶抑制剂）提取全细胞蛋白，BCA法测定蛋白浓度后，取20µL总蛋白行10%~12%SDS-PAGE，湿转于醋酸纤维膜，5%脱脂牛奶封闭1.5 h，分别加入I抗孵育过夜［Npas4（1∶500），Homer1a（1∶200），caspase-3和cleaved caspase-3（1∶1 000）及 β-actin（1∶4 000）］，PBST润洗3次，加入Ⅱ抗，室温孵育1.5 h，PBST洗膜3次，增强型HRP化学发光液显影压片，采用Gel-pro软件进行各个蛋白的相对表达水平分析。

3 统计学处理

采用GraphPad Prism 6软件进行统计分析及图表制作，数据均以均数±标准误（mean±SEM）表示。多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用最小显著性差异法。以P<0.05为差异具有统计学意义。

结 果

1 OGD/R损伤后，小鼠原代皮层神经元中Npas4和Homer1a表达水平上调

与对照组相比，OGD/R损伤后原代皮层神经元胞体皱缩、空泡化，并出现部分突起连接断裂，见图1；OGD/R损伤早期，Npas4（OGD 3 h和OGD/R 1 h）及Homer1a（OGD/R 1 h、OGD/R 3 h和OGD/R 6 h）的mRNA水平显著高于对照组（P<0.05），后逐渐恢复至正常水平，见图2。我们进一步检测其蛋白表达水平，Western blot结果显示Npas4和Homer1a的蛋白表达与mRNA变化趋势基本一致（P<0.05），见图3。

Figure 1.Morphological changes of primarily cultured cortical neurons.The scale bar=50µm.Compared with con⁃trol group（left），significant morphological changes were observed in OGD 3 h group（right），including neuronal debris，vacuolation and breakdown of neuro⁃nal networks.图1 原代皮层神经元的形态改变

2 Npas4-shRNA显著降低OGD/R引起的Npas4表达上调

为明确Npas4在OGD/R中的作用，采用Npas4-shRNA下调Npas4的表达水平。OGD/R损伤后1 h，其mRNA及蛋白水平均达高峰，故此时点用于Npas4-shRNA下调效率验证。与无关序列组相比，Npas4-shRNA可显著降低OGD/R所引起的Npas4蛋白表达上调（P<0.05），见图4，以此条件用于后续实验。

Figure 2.The mRNA levels of Npas4 and Homer1a in neurons were up-regulated in the early stage of OGD/R injury.Mean±SEM.n=3.*P<0.05 vs control group.图2 OGD/R损伤早期神经元中Npas4和Homer1a的mRNA水平上调

Figure 3.The protein levels of Npas4 and Homer1a in neurons were up-regulated in the early stage of OGD/R injury.Mean±SEM.n=3.*P<0.05 vs control group.图3 OGD/R损伤早期神经元中Npas4和Homer1a的蛋白表达水平上调

3 下调Npas4加重OGD/R引起的神经元损伤

下调Npas4的表达后予以OGD/R造模，24 h后采用CCK-8检测细胞活力，结果显示，与对照组相比，OGD/R组神经元细胞活力显著降低（P<0.05）；与OGD/R组及无关序列组相比，Npas4-shRNA组神经元细胞活力进一步降低（P<0.05），而OGD/R组与无关序列组间差异无统计学意义（P>0.05），见图5A。进一步采用LDH释放实验检测验证神经元损伤情况，与对照组相比，OGD/R组LDH释放显著增加（P<0.05）；与OGD/R组及无关序列组相比，Npas4-shR⁃NA组LDH释放进一步升高（P<0.05），OGD/R组与无关序列组间差异无统计学意义（P>0.05），见图5B。

Figure 4.The expression of Npas4 was knocked down by trans⁃fection with Npas4-shRNA.The protein level of Npas4 at 1 h after OGD/R injury were detected by Western blot.Mean±SEM.n=3.*P<0.05 vs control group；#P<0.05 vs scramble+OGD/Rgroup.图4 Npas4-shRNA敲减神经元中Npas4的表达

4 下调Npas4加重OGD/R诱导的神经元凋亡

进一步采用Western blot检测凋亡相关蛋白的表达以明确神经元凋亡的改变，结果显示，与OGD/R及无关序列组相比，Npas4 shRNA组中Bax/Bcl-2及cleaved caspase-3的蛋白表达水平均显著升高（P<0.05），见图6。

5 下调Npas4降低OGD/R引起的Homer1a表达上调

与对照组相比，OGD/R组Homer1a蛋白水平显著上调（P<0.05）；与OGD/R组及无关序列组相比，Npas4-shRNA组Homer1a蛋白水平显著降低（P<0.05），OGD/R组与无关序列组间蛋白表达差异无统计学意义（P>0.05），见图7。

Figure 5.Down-regulation of Npas4 aggravated neuronal injury after OGD/R.A：the cell viability was detected by CCK-8 assay；B：the LDH release was detected by Cytotoxicity Detection KitPLUS.Mean±SEM.n=3.*P<0.05 vs control group；#P<0.05 vs scramble+OGD/R group.图5 下调Npas4加重OGD/R引起的神经元损伤

讨 论

Npas4是新近发现的钙依赖性转录因子，参与调节突触兴奋-抑制的动态平衡，在神经环路的形成及调控突触可塑性中发挥重要作用。本研究通过体外培养的小鼠原代皮层神经元建立OGD/R模型，模拟脑缺血再灌注损伤，揭示Npas4在OGD/R损伤中可能发挥重要的调控作用。

既往研究表明，Npas4可被多种应激条件快速诱导表达，如神经元兴奋、癫痫及缺血等［7-8］。本研究显示，OGD/R损伤可引起Npas4的表达动态升高——损伤早期显著升高，后逐步恢复至生理水平。而神经元兴奋-抑制失衡，即兴奋性毒性，是脑缺血性损伤的关键致伤机制；同时，已有研究表明Npas4可增强抑制性突触传递，是神经元兴奋-抑制平衡重要调节分子［4，9］。据此，我们推测OGD/R损伤后，诱导高表达的Npas4可能通过减轻神经元兴奋-抑制失衡，从而减轻兴奋性毒性而发挥神经保护作用。进一步的Npas4基因干预实验也证实上述推论。慢病毒介导的Npas4表达下调，加重OGD/R所引起的神经元损伤，包括神经元活性降低、LDH释放量增加及细胞凋亡增加。因此，我们推测Npas4可减轻OGD/R诱导的神经元损伤。

Figure 6.Down-regulation of Npas4 aggravated neuronal apopto⁃sis after OGD/R.The protein levels of Bax，Bcl-2，caspase-3 and cleaved caspase-3 at 1 h after OGD/R injury were detected by Western blot.Mean±SEM.n=3.*P<0.05 vs control group；#P<0.05 vs scramble+OGD/Rgroup.图6 下调Npas4加重OGD/R引起的神经元凋亡

Figure 7.Down-regulation of Npas4 inhibited the up-regulation of Homer1a induced by OGD/R.The protein expres⁃sion of Homer1a at 1 h after OGD/R injury were de⁃tected by Western blot.Mean±SEM.n=3.*P<0.05 vs control group；#P<0.05 vs scramble+OGD/Rgroup.图7 下调Npas4抑制OGD/R引起的Homer1a表达上调

作为一重要的转录调控因子，Npas4的神经保护作用机制及其下游效应分子仍需进一步探讨。既往研究提示，Homer1a是突触兴奋-抑制平衡的重要直接调控分子，也是神经元兴奋性损伤的重要保护分子，然而其具体表达调控机制仍尚不清楚［10-13］。部分研究提示，Npas4与Homer1a基因启动子存在相互作用［14-15］；此外，脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）不仅是Homer1a的表达上调分子，同时也是Npas4重要的靶基因之一［7］。据此，我们推测Npas4可能通过上调Homer1a的表达，从而减轻OGD/R介导的神经元兴奋性损伤。我们的研究结果表明，OGD/R损伤后，Npas4的mRNA与蛋白表达高峰均早于Homer1a，提示Npas4可能诱导Homer1a表达；同时，下调Npas4的表达后，Homer1a的表达水平也显著降低。总结上述结果，OGD/R损伤后，Npas4的表达上调，并可能通过上调Homer1a的表达，从而调控神经元兴奋-抑制平衡发挥神经保护作用。

综上所述，OGD/R损伤后，Npas4表达呈动态上调，且可能通过上调Homer1a发挥一定的神经保护作用。然而，本研究仅通过基因下调反向证明Npas4的神经保护作用，Npas4过表达及其在体脑缺血再灌注实验仍需进一步完成，以阐明Npas4在脑缺血再灌注损伤中的确切作用及机制，为脑缺血治疗提供一定的参考资料。