心肌内向整流钾通道IRK 1激动剂后适应可减轻心肌细胞缺氧/复氧损伤*

刘清华， 许言午， 李 瑜， 刘文媛， 赵晓泽

（1山西医科大学病理生理教研室，山西太原030001；2上海中医药大学生化教研室，上海200032；3北京体育大学医院，北京100084；4山西医科大学第一医院，山西太原030001）

随着人们生活水平的提高和人口老龄化，冠状动脉粥样硬化性心脏病（简称冠心病）的发病率日益上升。冠心病基本的病理过程是心肌缺血，解除缺血病因，尽快建立缺血心肌的血液再灌注是治疗心肌缺血的根本措施。但有些病例在恢复缺血心肌的血液灌注之后，心功能反而恶化，甚至诱发心肌细胞不可逆性损伤，这种现象被称为缺血/再灌注损伤。缺血/再灌注损伤已经成为心脏介入治疗、搭桥手术和其他溶栓疗法中的最大隐忧。

2003 年，Zhao等［1］发现在缺血后给予一次或多次缺血和再灌注短循环，可以减轻再灌注后引起的损伤，具有心肌保护效应，并把这种处理称为缺血后适应（ischemic postconditioning）。由于后适应在心肌缺血发生后应用，比预适应更具临床实际操作性。随着对心肌缺血后适应内在机制的研究和阐明，人们尝试用药物模拟后适应的心肌保护效应，称为药物后适应（pharmacological postconditioning），如应用腺苷受体激动剂［2］、δ-阿片肽［3］及挥发性吸入麻醉药［4］等。心脏内向整流钾通道IRK1由Kir2.1、Kir2.2和Kir2.3亚基组成，其中Kir2.1是构成心室肌IRK1最主要的亚型。2012年我们课题组用大鼠研究发现，IRK1选择性激动剂扎考必利（zacopride，Zac）可增强心室肌内向整流钾电流，而对电压依赖性钙电流、电压依赖性钠电流、延迟整流钾电流和ATP敏感钾通道电流（缺血缺氧时开放）等影响动作电位的主要离子流无显著影响，此外，还可以增大静息电位（resting potential，RP），使膜超极化，轻度缩短动作电位时程（action potential duration，APD）［5］。细胞内钙超载被认为是心脏缺血/再灌注损伤的主要机制之一［6-8］。因而我们设想Zac是否可以通过激动IRK1，恢复RP，缩短APD，进而减少钙内流，抑制钙超载，从而减轻再灌注损伤。

为明确Zac对心肌再灌注损伤的作用及可能的机制，我们分别在体外培养的原代大鼠心室肌细胞和心肌H9c2（2-1）细胞系建立不同缺氧时间的缺氧/复氧（hypoxia/reoxygenation，H/R）模型以模拟急性缺血/再灌注损伤，用Zac后适应给药方式，探究激动心肌IRK1对心肌再灌注损伤的影响。

材料和方法

1 试剂及配制

盐酸扎考必利（zacopride hydrochloride）购自Tocris；胶原酶P购自Roche。配制台氏液（mmol/L）：NaCl 140，KCl 5.4，NaH2PO40.33，HEPES 5.0，glu⁃cose 10，MgCl21.0，CaCl21.8，用NaOH调节pH至7.38。酶液为无钙台氏液中加入taurine 20 mmol/L和胶原酶0.07~0.10 g/L。配制KB液（mmol/L）：KOH 85，L-glutamic acid 50，KCl 30，taurine 20，KH2PO430，MgCl21，HEPES 10，glucose 10，EGTA 0.5，用KOH调节pH至7.4。

2 方法

2.1 在大鼠心室肌细胞建立H/R模型以模拟急性缺血/再灌注损伤 方法参见Diaz等［9］的文章进行。取6只成年雄性SD大鼠，麻醉后迅速开胸取出心脏，悬挂于Langendorff装置进行灌流。先用无钙台氏液灌流10 min，再用含有胶原酶的无钙台式液循环灌流约20 min。取左心室肌放入KB液中轻轻吹打，滤网过滤后保存于KB液中。实验前先将细胞逐步复钙（Ca2+终浓度为1.8 mmol/L）后分别放入6个1.5 mL的EP管中，调整细胞悬液体积为1.2 mL。细胞悬液经45×g离心2 min后在EP管底部形成约8~10 mm厚的细胞层，调整上清液体积约为细胞层体积的1/3，滴加3~4 mm厚的矿物油以隔绝空气，分别缺氧45 min或75 min。之后去除石蜡油并更换新鲜台氏液，再复氧30 min。2种损伤模型中，细胞均随机分成6组：常氧对照组（normoxia组），H/R组，0.1、1和10µmol/L Zac+H/R组，以及0.1µmol/L Zac+1µmol/L BaCl2+H/R组。后适应组分别在再灌注即将开始前给药，细胞全程经37℃水浴。实验结束后，所有细胞经PBS冲洗2次，弃去上清，−70℃冻存备用。Western blot测定各组心肌细胞Kir2.1蛋白的表达。

2.2 H/R大鼠心室肌细胞内游离钙浓度（［Ca2+］）i的检测 用含0.5%牛血清白蛋白（bovine serum albu⁃min，BSA）和CaCl2的Tyrode溶液对H/R实验心室肌细胞进行梯度复钙，最终CaCl2浓度为1 mmol/L。Ca2+荧光指示剂Fluo-4/AM用于指示［Ca2+］i。37℃恒温避光，5µmol/L Fluo-4/AM孵育细胞0.5 h，之后用PBS洗涤肌细胞2次，去除未结合的指示剂。采用FV1000激光共聚焦扫描显微镜（Olympus）检测心肌细胞内游离钙离子的荧光密度。

2.3 在H9c2（2-1）心肌细胞建立H/R模型 来源于大鼠胚胎心脏组织的心肌H9c2（2-1）细胞购于中国科学院细胞库（上海）。H/R模型制备方法参见孔令恒等［10］的研究进行。为了模拟体外心肌I/R，将融合度为80%的H9c2（2-1）细胞置于37℃、95%N2和5%CO2的三气培养箱中分别缺氧孵育3 h或5 h，然后分别加入0.1、1和10µmol/L Zac（后适应），立即转入95%O2、5%CO2的培养箱中复氧2 h。对照培养皿在37℃、95%O2、5%CO2的环境下分别孵育5 h或7 h。两种损伤模型中，细胞均随机分为6组：常氧对照组，H/R组，0.1、1和10µmol/L Zac+H/R组，以及0.1µmol/L Zac+1µmol/L BaCl2+H/R组。复氧结束后，从各培养皿中收集培养液进行乳酸脱氢酶（lactate de⁃hydrogenase，LDH）释放检测，裂解并收集细胞进行凋亡蛋白caspase-3的检测。同时，将细胞接种于96孔板24 h后，按照上述H/R方案，通过CCK-8法检测细胞存活率。

2.4 LDH释放的检测 LDH细胞释放检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所。按照制造商提供的说明进行检测。将细胞培养上清液加入96孔板中。每孔加入依次LDH反应试剂，混和均匀，37℃避光孵育30 min。所有对照品和样品于450 nm波长处的吸光度（A）通过EMax®酶标仪（Molecular Device）测定。

2.5 评估心肌细胞凋亡 Caspase-3检测试剂盒购自上海北沪生物科技有限公司。实验根据厂家说明书进行。收集各组细胞，4℃裂解10 min，离心（10 000×g，5 min）后，将上清转移到新的EP管中。在96孔板中，测试孔每孔加10µL待测上清和40µL稀释液，在标准孔中加入50µL标准样品。然后在每孔中加入100µL辣根过氧化物酶标记试剂，37℃孵育60 min。彻底冲洗反应物，每孔中加入底物A和B在37℃下避光孵育15 min。之后在在15 min内以450 nm波长读取A值，根据标准曲线计算活化的caspase-3浓度。

2.6 检测心肌H9c2（2-1）细胞的活力 按照生产商说明书，使用CCK-8试剂盒检测细胞活力。以每孔1×104个细胞的密度接种在96孔板，直到融合度达80%。细胞暴露于3 h缺氧及2 h复氧（H/R）环境。然后以每孔10µL加入CCK-8试剂，37℃恒温孵育4 h。之后在15 min内用EMax®酶标仪在450 nm波长处读取A值。每组10个平行数据，取平均值。

2.7 Western blot实验 从细胞中提取的蛋白质加载于5%~15%的丙烯酰胺凝胶上（每孔40µg）。经电泳转膜和5%脱脂奶粉溶液封闭后，硝酸纤维素膜与靶蛋白抗体Kir2.1（1∶1 000，Sigma）、PI3K和磷酸化PI3K（1∶1 000，CST）、Akt和磷酸化Ak（t1∶1 000，Abcam）、GAPDH（1∶1 000，CST）在4℃下孵育过夜。加入Ⅱ抗孵育后经化学发光法在凝胶成像系统显影成像。对结果进行保存，分析使用。应用ImageJ和Image Lab软件对条带进行半定量分析。

3 统计学处理

用SPSS17.0软件包进行数据处理和统计学分析。所有数据以均数±标准误（mean±SEM）表示。多组间比较用单因素方差分析，各组均数的两两比较用SNK-q检验或Games-Howell分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 H/R对大鼠心室肌细胞Kir2.1通道蛋白表达的影响

如图1所示，成年大鼠心室肌细胞H/R模拟急性缺血/再灌注损伤时，Kir2.1的表达显著下调（P<0.05）；0.1~10µmol/L Zac后适应可上调心肌Kir2.1的表达（P<0.05），且随着缺血时间的延长（由45 min延长至75 min），Zac后适应仍然发挥良好的保护效应，可以维持心肌Kir2.1的表达。

2 H/R对大鼠心室肌细胞［Ca2+］i变化的影响

心肌细胞内Ca2+超载是造成缺血/再灌注损伤的重要机制之一。为了检测细胞内［Ca2+］i是否受到IRK1激活的影响，我们应用Ca2+荧光指示剂Fluo-4/AM，在激光共聚焦显微镜下观察了心肌细胞内的Ca2+荧光强度。根据大鼠离体心肌细胞再灌注损伤时Kir2.1表达的变化和课题组前期结果，我们选择0.1µmol/L Zac后适应处理心肌细胞。如图2所示，与常氧组相比，H/R使心肌细胞［Ca2+］i明显升高（P<0.05），且随着缺氧时间的延长，复氧后细胞内钙超载逐渐加重；Zac后处理可明显降低心肌细胞内Ca2+的荧光强度（P<0.05），1µmol/L BaCl2可有效逆转Zac的作用，使心肌细胞内Ca2+的荧光强度提高（P<0.05），表明Zac抑制心肌细胞内钙超载的作用是由其激动IRK1介导的。

Figure 1.Zacopride（Zac）up-regulated the expression of Kir2.1 in rat ventricular myocytes with hypoxia/reoxygenation（H/R）.A：hypoxia for 45 min and reoxygenation for 30 min；B：hypoxia for 75 min and reoxygenation for 30 min.Mean±SEM.n=3.*P<0.05，**P<0.01 vs normoxia group；#P<0.05 vs H/Rgroup；&P<0.05 vs0.1µmol/L Zac+H/Rgroup.图1 Zac上调H/R时大鼠心室肌细胞Kir2.1的表达

Figure 2.Zacopride（Zac）treatment inhibited hypoxia/reoxygenation（H/R）-induced intracellular Ca2+（［Ca2+］）iaccumulation in adult rat ventricular myocytes.A：hypoxia for 45 min and reoxygenation for 30 min；B：hypoxia for 75 min and reoxygen⁃ation for 30 min.Mean±SEM.n=6.*P<0.05 vs normoxia group；#P<0.05 vs H/Rgroup；&P<0.05 vs Zac+H/Rgroup.图2 Zac可抑制H/R诱发的心室肌细胞内钙超载

3 Zac后适应可减轻H9c2（2-1）细胞H/R损伤

考虑到后适应的可预期优势，我们建立了H9c2（2-1）心肌细胞的H/R模型，以进一步阐明Zac发挥心脏保护的潜在机制。H/R可诱导心肌细胞释放LDH、引起caspase-3活化并减低心肌细胞活力（P<0.05），并且随着缺氧时间延长（由3 h延长至5 h），细胞损伤逐渐加重；0.1µmol/L Zac可有效减轻H/R损伤，其在更长时间的H/R模型中对细胞损伤具有更强的保护作用（P<0.05）；1µmol/L BaCl2可部分逆转Zac的保护效应（P<0.05），见图3。这些表明Zac可通过激活IRK1减轻H/R诱导的心肌细胞损伤。

4 Zac后适应可激活PI3K/Akt信号通路

在心肌H9c2（2-1）细胞中，H/R抑制了PI3K/Akt的活性（P<0.05），这是H/R诱导caspase-3激活的重要机制之一；0.1~10µmol/L Zac可促进PI3K/Akt磷酸化，随着缺氧时间的延长，0.1µmol/L Zac表现出对PI3K/Akt信号更强的激活效应，且其效应可被低剂量IRK1阻滞剂BaCl2消除，见图4。

Figure 3.Effects of zacopride（Zac）postconditioning on injury of H9c2（2-1）cells with hypoxia/reoxygenation（H/R）.Cell viability was measured by CCK-8 assay，LDH release was detected by LDH-release assay kit，and the concentration of caspase-3 in cardiomyocytes was detected by caspase-3 assay kit.A：hypoxia for 3 h and reoxygenation for 2 h；B：hypoxia for 5 h and reoxygenation for 2 h.The scale bar=100µm.Mean±SEM.n=6.*P<0.05，**P<0.01 vs normoxia group；#P<0.05，##P<0.01 vs H/Rgroup；&P<0.05 vs0.1µmol/L Zac+H/Rgroup.图3 Zac后适应可减轻H9c2（2-1）细胞H/R损伤

讨 论

再灌注过程中的不可逆性细胞损伤可导致心肌坏死和凋亡，其机制主要包括细胞内钙超载、大量活性氧簇产生和中性粒细胞活化。减轻细胞内钙超载被认为是防止心肌再灌注损伤的重点策略。心肌缺血时，由于膜损伤和Na+-K+泵失灵，导致细胞外钾离子浓度（［K+］o）增高，心肌细胞膜去极化［11-12］，膜损伤和去极化最终导致胞外钙离子内流增加。再灌注过程中细胞损伤和离子紊乱进一步加重。氧化应激、过度活化的Na+-Ca2+交换反向转运及Na+/H+交换（用于修正细胞内酸中毒）又极大地促进了钙超载。内向整流钾电流IKI是在心肌细胞上发生最早的钾电流，是心肌最主要的背景外向电流。除了决定RP，IRK1的内向整流特性对维持心肌细胞的长平台期和3期复极化有重要作用。IRK1抑制将减少复极储备钾电流，延缓动作电位3期终末复极化，由此增加L型钙通道的复活，促进钙超载的发生。适度激动IRK1将增大RP，缩短APD，从而减轻心肌细胞内钙超载。

本研究发现，Zac后适应的最适效应浓度为0.1µmol/L，较课题组在其他疾病模型，如缺血和乌头碱诱发的心律失常研究中的最适浓度（1µmol/L）约相差10倍［5，13］。Zac对再灌注所致细胞损伤的保护作用可能与其改善再灌注过程中的电生理障碍有关。尽管在缺血期和再灌注期，IRK1均被证明可发生抑制，但再灌注早期，由于血液对细胞外K+的冲刷以及胞内高钠负荷激活Na+-K+泵而使［K+］o迅速降低，加上净外向产电性泵离子流，细胞膜可发生短暂超极化和有效不应期缩短，高浓度Zac会加强这些变化，从而在缺血区、周边区和远隔区形成动作电位和兴奋性的不均一或离散。低浓度（0.1µmol/L）Zac既可以维持缺血区心肌细胞静息电位，适度缩短APD而抑制钙超载，又可防止动作电位时程过度离散。此外，本课题组在前期研究中发现Zac后适应可抑制大鼠冠状动脉左前降支结扎/松扎所诱导的再灌注性心律失常，0.1µmol/L亦为其最适效应浓度，并证明抑制细胞内钙超载诱发的延迟后除极（delayed af⁃ter depolarization，DAD）是其抗再灌注心律失常的主要机制之一［14］。van der Weg等［15］认为，再灌注心律失常和再灌注损伤可能不是两个独立的过程，而是同一过程的两种不同结果，再灌注心律失常可被视为再灌注损伤的标志。结合本研究，我们认为以钙超载为中心，心肌缺血再灌注时出现的电生理学紊乱如IRK1抑制、APD延长、钠钙交换反向转运增强等与心肌细胞结构损伤或功能障碍如细胞坏死、凋亡、线粒体损伤和心泵功能障碍等可能相互作用，互相促进。电学紊乱可能触发结构损伤，而结构损伤亦可能诱发或加重电学紊乱。Zac通过恢复心肌IRK1生理性表达，抑制钙超载，在减轻细胞损伤的同时，亦改善了心肌电紊乱，这可能也是Zac拮抗再灌注心律失常的机制之一。

Figure 4.Zacopride（Zac）activated PI3K/Akt signaling pathway in the H9c2（2-1）cells with hypoxia/reoxygenation（H/R）.A：hy⁃poxia for 3 h and reoxygenation for 2 h；B：hypoxia for 5 h and reoxygenation for 2 h.Mean±SEM.n=3.*P<0.05 vs nor⁃moxia group；#P<0.05，##P<0.01 vs H/Rgroup；&P<0.05，&&P<0.01 vs0.1µmol/L Zac+H/Rgroup.图4 Zac激活H/R心肌H9c2（2-1）细胞PI3K/Akt信号通路

阜外医院的研究者曾应用1µmol/L Zac联合6个循环的短暂冠脉松扎/结扎（即缺血后适应）的方法，发现可以明显减轻再灌注心肌损伤，其机制主要是抑制再灌注诱发的氧化应激［16］。

已有大量证据表明，缺血/再灌注不仅导致细胞坏死，还可诱导细胞凋亡。细胞活力、LDH释放和caspase-3活化是与细胞死亡相关的可靠指标。本研究显示Zac后适应可通过激动IRK1明显减轻心肌细胞的坏死和凋亡，其保护机制可能是：（1）Zac通过减轻细胞钙超载或氧化应激减少细胞死亡。细胞内钙超载可激活Ca2+/Mg2+依赖的核酸内切酶和谷氨酰胺转移酶，可降解DNA和细胞骨架蛋白，从而诱导凋亡。Zac具有确切的抑制细胞内钙超载及凋亡的作用。（2）Zac通过激活PI3K/Akt通路促进细胞生存。再灌注时，PI3K/Akt信号通路是调节细胞存活的关键机制之一［17］，其下游重要靶点包括内皮型一氧化氮合酶［18］和线粒体膜通透性转换孔（mitochondrial permeability transition pore，mPTP）。mPTP是一种与线粒体内外膜接触位点相关的非特异性孔，是再灌注损伤的关键末端效应因子。在心肌发生缺血再灌注损伤时，PI3K/Akt通路被抑制。而Zac后适应可IRK1依赖性激活PI3K/Akt。抑制钙激活的凋亡通路和/或激活促生存通路可以很好地解释Zac的细胞保护作用。

由于急性心肌缺血/梗死的发生通常是不可预知的，因此，缺血后尽早应用Zac抑制再灌注损伤更具临床价值。IRK1可作为研发抗缺血/再灌注损伤药物的新靶点，通过激动心肌IRK1减轻心肌细胞内钙超载以及激活PI3K/Akt通路是减轻再灌注损伤的有效甚至强有力的策略。IRK1激动剂可能是潜在的预防或减轻心肌缺血/再灌注损伤的药物。