炎性巨噬细胞糖酵解水平与动脉粥样硬化的研究进展*

曹小如， 赵雪竹， 谭凡成， 田 野， 时 飒△

（1哈尔滨医科大学病理生理学教研室，黑龙江哈尔滨150001；2哈尔滨医科大学附属第一医院心血管内科，黑龙江哈尔滨150001）

动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）作为一种慢性代谢性疾病，是冠心病、脑卒中和外周血管疾病的共同病理学基础，常伴有动脉炎症反应［1］。根据AS的“炎症学说”，在早期血管病变中，循环中的单核细胞募集至病变部位，浸润至血管壁内膜下并分化形成巨噬细胞，分泌细胞因子介导免疫清除反应［2］。随着斑块进展，病原体相关分子模式［如脂多糖（li⁃popolysaccharides，LPS）］或损伤相关分子模式［如氧化型低密度脂蛋白（oxidized low-density lipoprotein，oxLDL）］可通过与巨噬细胞膜表面模式识别受体结合，激活斑块内巨噬细胞炎症反应，加剧AS发展［3］。近年，代谢活动参与调节免疫细胞炎症功能备受关注［4］。Bekkering等［5］报道，与正常对照组相比，有缺血症状AS患者循环中的单核细胞糖酵解代谢明显增加，强调了糖酵解过程参与AS进展的临床意义。斑块内巨噬细胞糖酵解代谢增加表现出炎性M1型巨噬细胞表型，而降低糖酵解可以减轻巨噬细胞炎症，进而抑制AS进展［6-8］。因此，本文综述炎性巨噬细胞的糖酵解及其调控机制，以及巨噬细胞糖酵解代谢调控AS相关研究，并探讨降低炎性巨噬细胞糖酵解减轻AS的治疗策略。

1 细胞糖酵解代谢增加的意义

1923 年，奥托·沃伯格证实肿瘤细胞在有氧条件下仍以较高速率的糖酵解代谢为主，这一现象被称为Warburg效应［9］。进一步研究证实，由于恶性增殖的肿瘤细胞对生物大分子和生物能量的需求增加，细胞糖酵解代谢增加，从而提高自身对缺氧环境的耐受能力，以及在有氧条件下与正常细胞竞争生存的能力。高通量糖酵解在短时间内可以比线粒体氧化磷酸化产生更多ATP［10］。并且，糖酵解中间产物6-磷酸葡萄糖分流到磷酸戊糖途径（pentose phos⁃phate pathway，PPP）生成核糖、NADPH等促进核酸、脂肪酸和固醇等大分子物质合成，从而参与细胞核、膜结构生成和氧化还原反应调控，促进细胞合成代谢［11］。此外，一般认为丙酮酸进入线粒体生成乙酰辅酶A，作为三羧酸（tricarboxylic acid，TCA）循环的主要碳源。而Hui等［12］证实在缺氧或高能量需求时，循环中乳酸是除大脑外所有组织TCA循环的主要碳源。因此，细胞糖酵解代谢增加可以快速提供细胞活化所需的能量和生物大分子物质。与肿瘤细胞类似，糖酵解增加是免疫细胞快速活化的标志性代谢改变［13］。M1型巨噬细胞、活化的树突状细胞和Th17细胞等被炎症因子激活，细胞糖酵解代谢增加，能够快速产生ATP和生物大分子物质来执行其特定的效应功能，如巨噬细胞的吞噬作用、炎性细胞因子产生、树突状细胞的抗原呈递和Th17细胞的效应细胞因子IL-17产生［14］。

2 巨噬细胞糖酵解代谢

细胞代谢在巨噬细胞活化过程中发挥着决定性作用。M1和M2型巨噬细胞利用不同的代谢方式为其效应功能提供能量。M1型巨噬细胞利用糖酵解代谢为剧烈、短暂的杀菌或促炎反应迅速提供能量；而M2型巨噬细胞利用线粒体氧化磷酸化和脂肪酸氧化（fatty acid oxidation，FAO）长时间、持续地生成ATP，为组织修复提供助力［15］。这些代谢差异最初被认为反映细胞的底物利用，但现在研究认为细胞能量代谢转变可以直接改变巨噬细胞的极化状态和炎症反应。巨噬细胞代谢转向糖酵解，促进炎性M1型巨噬细胞表型［16］。2-脱氧-D-葡萄糖（2-deoxy-D-glucose，2DG）是一种葡萄糖类似物，能够竞争性地抑制糖酵解，研究证实2DG通过阻断M1型巨噬细胞糖酵解，抑制其炎症表型包括吞噬功能、炎性细胞因子分泌及活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）产生［16-17］。而另有研究证实，乙莫克舍（etomoxir）是一种FAO代谢关键酶肉毒碱棕榈酰基转移酶1α（carni⁃tine palmitoyl transferase-1α，CPT-1α）抑制剂，可以降低M2型巨噬细胞的线粒体耗氧率和储备呼吸能力，从而抑制M2型巨噬细胞的线粒体氧化磷酸化，并减少其表面标志物CD301、CD206和RELMα的表达［18］。过表达巨噬细胞过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1β可驱动线粒体氧化磷酸化，促进M2型巨噬细胞激活并抑制炎症因子产生［19］。因此，通过干预代谢方式调控巨噬细胞的极化状态和炎症反应有利于炎症性疾病的治疗。

目前调控炎性巨噬细胞糖酵解上调的机制已基本明确。Rodríguez-Prados等［15］使用基于葡萄糖示踪物的代谢组学方法证实，多种Toll样受体（Toll-like receptors，TLRs）途径激活均可增加小鼠腹腔原代巨噬细胞糖酵解代谢。以被广泛研究的TLR4配体LPS和干扰素γ（interferon-γ，IFN-γ）刺激的M1型巨噬细胞为例，调控炎性巨噬细胞糖酵解代谢的机制主要包括3种途径：（1）直接改变糖酵解蛋白表达水平：LPS促进6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2，6-二磷酸酶（6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2，6-bisphosphatase，PFK2）亚型表达发生变化，从肝脏形式（liver form，LPFK2）转为更活跃的普遍存在形式（ubiquitous form，u-PFK2），而u-PFK2催化6-磷酸果糖生成2，6-二磷酸果糖，后者的浓度增加可激活糖酵解关键酶6-磷酸果糖激酶1（phosphofructokinase 1，PFK1），增加糖酵解通量［15］。同时，LPS快速下调巨噬细胞碳水化合物激酶样蛋白（carbohydrate kinase-like protein，CARKL），从而增加PPP通量，维持M1型巨噬细胞合成代谢［20］。（2）缺氧诱导因子（hypoxia-inducible factor，HIF）依赖性途径：Blouin等［21］证明LPS刺激巨噬细胞HIF-1α蛋白稳定表达，并形成功能性异二聚体复合物，与糖酵解相关基因和炎症基因的缺氧反应元件结合，激活炎性M1型巨噬细胞表型。同时，NF-κB、AKT/mTOR等炎症通路同样可以调节HIF-1α表达，促进糖酵解代谢［22-24］。另外，M1型巨噬细胞TCA循环中2个环节受损，导致琥珀酸和柠檬酸累积，过量的琥珀酸抑制脯氨酸羟化酶的活性，从而维持HIF-1α稳定［25］。而柠檬酸转运到细胞质生成NADPH，促进炎症介质ROS生成，ROS具有稳定HIF-1α表达的作用，HIF-1α增加进一步激活糖酵解基因的转录，从而维持M1型巨噬细胞糖酵解代谢［26］。此外，存在LPS刺激的情况下，缺氧激活HIF-1α通路更显著增加巨噬细胞糖酵解通量［6］。（3）非HIF依赖性途径：LPS激活巨噬细胞信号级联反应募集肿瘤坏死因子受体相关因子6（tumor necrosis factor receptor-associ⁃ated factor 6，TRAF6）和TANK结合激酶1（TANK-binding kinase-1，TBK-1），TBK-1磷酸化信号转导及转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）的第727位丝氨酸残基，促进M1型巨噬细胞糖酵解增加和炎性细胞因子的产生［27］。Hedl等［28］证实，LPS激活干扰素调节因子5（interferon regulatory factor 5，IRF5）-AKT2信号通路，M1型巨噬细胞糖酵解增加，并促进M1型巨噬细胞极化。

3 单核-巨噬细胞糖酵解增加促进AS进展

在AS早期病变时，骨髓造血细胞的糖酵解促进髓系细胞生成，导致循环中单核细胞在斑块的积累增加，间接促进斑块病变生长［8，29］。而单核细胞的糖酵解增加同样促进AS的进展。与健康个体的循环单核细胞相比，AS患者的循环中单核细胞具有更高的糖酵解通量，其中单核细胞糖酵解增加程度与线粒体活性氧生成、氧化应激和炎症信号激活程度成正比［6］。在进展性病变中，斑块内巨噬细胞在氧化脂质、氧化应激和缺氧等刺激下，稳定表达HIF-1α，并且和葡萄糖转运蛋白1（glucose transporter 1，GLUT1）、己糖激酶2（hexokinase 2，HK2）和丙酮酸脱 氢 酶 激 酶1（pyruvate dehydrogenase kinase 1，PDK1）的表达同步，表明斑块巨噬细胞糖酵解代谢增强。此外，在斑块内富含巨噬细胞区域IL-1β同样高表达［30-31］，说明糖酵解增加参与AS斑块炎症进展。另一项动物研究中，骨髓特异性敲除Hif-1α低密度脂蛋白受体敲除（low-density lipoprotein receptor knockout，Ldlr-/-）小鼠的AS斑块形成被抑制，进一步证实了HIF-1α及其介导的糖酵解在AS进展中的促进作用［32］。

然而，另有研究指出适度的糖酵解过程可以维持巨噬细胞吞噬功能，过度抑制糖酵解反而加剧AS进展。Morioka等［33］的研究证实，Slc2a1基因（编码GLUT1的基因）敲除小鼠的骨髓源性巨噬细胞表现出胞吞能力下降；将髓系Slc2a1缺陷小鼠的骨髓移植到Ldlr-/-小鼠骨髓内，高脂喂养12周后，小鼠主动脉根部斑块坏死核心区面积显著增加，坏死核心区内凋亡细胞的数量也显著增加，表明斑块内Slc2a1缺失巨噬细胞有效吞噬功能下降。因此，适度的糖酵解也是调节巨噬细胞有效吞噬的关键，可以防止形成斑块坏死核心区，避免易损斑块破裂。

4 抑制丙酮酸激酶M 2（pyruvate kinase M 2，PKM 2）通过介导糖酵解减轻AS进展

PKM2是糖酵解最后一个关键限速酶，在肿瘤细胞中特异性地高表达。PKM2主要以2种构型存在：四聚体形式（非活跃状态）和二聚体形式（活跃状态）。四聚体PKM2具有糖酵解酶活性，催化磷酸烯醇式丙酮酸生成丙酮酸。二聚体PKM2具有磷酸激酶活性，通过转移进入细胞核与具有调控活性的蛋白相互作用从而促进靶基因的转录。此外，二聚体PKM2可以被分泌至细胞外，血浆和粪便中的PKM2可作为大肠癌、乳腺癌等的诊断标志物［34］。

近年，PKM2被证实在炎性巨噬细胞中亦高表达，同时介导免疫相关功能。PKM2不仅是受HIF-1α调控的靶基因，它还直接与HIF-1α相互作用并促进HIF-1α调控基因的转录。Palsson-McDermott等［35］发现，LPS诱导巨噬细胞二聚体PKM2转移入细胞核，作为HIF-1α的结合蛋白，促进糖酵解基因和炎症基因IL-1β转录（图1）；选择性PKM2小分子激活剂TEPP-46（ML265）可以恢复PKM2酶活性，促使PKM2四聚体化，并阻止二聚体PKM2核转位，还可以抑制LPS诱导的巨噬细胞糖酵解和IL-1β表达，从而促进M1型巨噬细胞向M2型转化。同时，PKM2促进巨噬细胞NLRP3（NLR family pyrin domain con⁃taining 3）炎症小体和AIM2（absent in melanoma 2）炎症小体的激活；PKM2依赖的糖酵解可促进RNA依赖性蛋白激酶（RNA-dependent protein kinase，PKR）的磷酸化，从而诱导巨噬细胞NLRP3炎症小体激活，分泌IL-1β、IL-18和高迁移率族蛋白B1［36-37］。

PKM2最初通过增加肿瘤细胞Warburg效应促进肿瘤生长。Shirai等［7］证实，PKM2同样参与AS的发生，冠心病患者循环单核细胞体外分化的巨噬细胞表现出二聚体PKM2表达增加、糖酵解通量增加和ROS生成上调，二聚体PKM2转位到细胞核，磷酸化STAT3，导致下游炎症因子IL-1β和IL-6表达增加。Kumar等［38］证实，oxLDL诱导巨噬细胞源性泡沫细胞中PKM2第105位酪氨酸残基磷酸化，并促进PKM2转位入核，增加HIF-1α靶基因Ldha、Slc2a1和Il-1β的转录及IL-1β的分泌，从而促进糖酵解代谢和炎症反应。紫草素（shikonin，SKN）是PKM2的有效抑制剂，通过抑制巨噬细胞糖酵解代谢发挥抗炎作用［36，39］。SKN可以减缓高同型半胱氨酸血症诱导的载脂蛋白E敲除（apolipoprotein E knockout，ApoE-/-）小鼠AS的形成，降低了主动脉斑块内炎症因子TNF-α、IL-1β和ICAM-1的表达。这种治疗作用主要由于SKN对PKM2的抑制，从而减弱了细胞活化所需的糖酵解代谢［40］。因此，糖酵解限速酶PKM2是减轻巨噬细胞炎症、预防AS的新靶点。

5 靶向降低巨噬细胞糖酵解代谢水平可减轻AS炎症

降脂治疗虽然有效降低了心血管疾病的患病风险，但是患者仍存在残余风险，部分原因是低度慢性炎症未减轻［41］。CANTOS试验显示，用canakinumab靶向IL-1β可降低事件复发的风险，表明抗炎策略在AS治疗中具有很大的应用前景［42］。直接的全身抗炎治疗有影响机体免疫功能及增加肿瘤风险的可能性，而干预巨噬细胞代谢的方式提高了抗炎治疗的靶向性。

二甲双胍作为2型糖尿病的一线治疗药物，通过调节胰岛素靶细胞线粒体功能和能量传感器AMP活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）活性来改善葡萄糖和脂肪酸代谢［43］。He等［44］的研究表明，二甲双胍可减轻oxLDL诱导的脂质氧化，增强GLUT1介导的葡萄糖转运，并且增加线粒体氧化代谢，从而诱导炎性巨噬细胞向抗炎表型转变。单核细胞受到炎性刺激如oxLDL，通过代谢和表观遗传重编程诱导持久的促炎症、致AS表型称为训练免疫［45］。Keating等［46］的研究评估了糖酵解基因变异对单核细胞训练免疫能力的影响，结果显示糖酵解酶磷酸果糖激酶2/果糖-2，6-二磷酸酶3（phosphofructo⁃kinase-2/fructose-2，6-bisphosphatase 3，PFKFB3）和血小板型磷酸果糖激酶（the platelet isoform of phos⁃phofructokinase，PFKP）的突变可以降低oxLDL诱导的训练免疫能力；而体内给予二甲双胍使oxLDL诱导人外周血单核细胞训练免疫的能力减弱。上述研究提示二甲双胍作为AS抗炎治疗药物的可能性。但是二甲双胍作为降糖药物可导致患者乳酸中毒，并且目前临床只适用于高血糖患者的AS防治。

Figure 1.Schematic diagram of the mechanism of glycolysis regulation in inflammatory M1 macrophages.Glucose uptake increases in M1 macrophages stimulated by LPSand IFNγ.LPSincreases glycolytic flux through down-regulating CARKL protein ex⁃pression and up-regulating u-PFK2 expression.LPSalso impairs the TCA cycle，and causes the accumulation of citrate and succinate.Citrate is transported to the cytoplasm to generate NADPH，which promoting ROSgeneration.ROSand succi⁃nate stablize the expression of HIF-1α，thereby increasing the transcription of target genes related to glycolysis and IL-1β.Simultaneously，inflammatory pathways such as NF-κB and AKT/mTOR regulate the expression of HIF-1αto promote gly⁃colytic metabolism.In addition，with the stimulation of LPS，hypoxia significantly enhances glycolytic metabolism by acti⁃vating the HIF-1αpathway.Finally，LPSactivates signaling cascade to recruit TRAF6-TBK-1 protein and activates the IRF5-AKT2 signaling through a non-HIF-1α-dependent pathway，leading to macrophage glycolysis enhancement and fol⁃lowing activation of M1 macrophage inflammation.图1 炎性M 1巨噬细胞糖酵解代谢调节机制的示意图

微小RNA（microRNA，miRNA，miR）参与调控巨噬细胞极化被广泛报道［47］。Ouimet等［48］证实，miR-33通过改变巨噬细胞代谢方式调节细胞炎症表型；抑制巨噬细胞miR-33表达可以激活AMPK通路，上调FAO，并减弱糖酵解代谢，从而诱导巨噬细胞转化为M2表型；体内抗miR-33治疗可以减少小鼠主动脉斑块面积；通过激光捕获显微切割分离Ldlr-/-小鼠斑块病变巨噬细胞，与对照组相比，抗miR-33治疗后小鼠斑块内M2型巨噬细胞标志基因（Arg1和Mrc1）富集，而M1型巨噬细胞标志基因（Ifnb1、Il1a和Nox1）表达减少。抗miR-33治疗虽然可以诱导巨噬细胞转化为M2表型，但不能排除对体内其他类型细胞的影响，且目前尚缺乏临床试验证明其安全性及有效性。

6 总结与展望

巨噬细胞的表型转化和炎症反应与细胞糖酵解代谢的关系紧密交织，炎性巨噬细胞糖酵解的增加促进AS斑块的起始、进展及转归。研究显示，二甲双胍和miRNA抑制剂等可以降低巨噬细胞糖酵解速率，增加线粒体氧化代谢，抑制炎症反应，从而减轻AS，提示降低炎性巨噬细胞糖酵解水平可能成为AS的治疗策略。但是，目前从抑制巨噬细胞糖酵解出发，开展AS防治研究仍面临众多挑战，例如在体斑块内巨噬细胞代谢表型鉴定技术仍不完善、斑块内巨噬细胞糖酵解代谢相关分子靶点仍有待探索等。因此，深入探究炎性巨噬细胞糖酵解相关分子靶点并开发在体代谢表型检测技术，有望为研究者从抑制AS中巨噬细胞糖酵解代谢出发稳定和逆转AS提供理论基础和有效技术手段。