右美托咪定通过抑制TLR4/NF-κB信号通路促进佐剂性膝骨关节炎大鼠成纤维细胞样滑膜细胞凋亡*

邢丹丹， 康文越， 王志华， 王 颖， 李 娜， 吴多志， 林 慧

（海南省人民医院，海南海口570311）

膝骨关节炎（knee osteoarthritis，KOA）表现为关节软骨损伤、滑膜炎症和滑膜增生，是骨关节炎中常见类型［1］。成纤维细胞样滑膜细胞（fibroblast-like synoviocytes，FLS）作为KOA中参与发病机制的主要细胞，可参与滑膜血管形成、炎症等过程［2］，特别是其出现的肿瘤样特征，包括过度增殖和凋亡不足导致滑膜组织异常增生现象［3］，因此促进FLS凋亡成为KOA的潜在治疗方法。右美托咪定（dexmedetomi⁃dine，DEX）作为α2受体激动药物，具有调控肿瘤细胞增殖和凋亡作用［4］，研究发现在KOA中DEX能够抑制软骨细胞凋亡，进而缓解疾病［5］，但在FLS中尚未发现相关研究。Toll样受体4（Toll-like receptor 4，TLR4）/核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）通路在KOA中发挥重要作用，不仅可介导促炎症因子和基质金属蛋白酶等影响疾病状态［6］，而且对细胞凋亡和细胞外基质代谢具有重要调控作用［7］，推测TLR4/NF-κB信号通路可能与DEX调控FLS凋亡机制存在一定关系。因此，本研究采用弗氏完全佐剂（Freund's complete adjuvant，FCA）建立KOA大鼠模型，探究DEX对FLS凋亡的影响，并探究其机制。

材料和方法

1 动物

SPF级健康SD大鼠，购自北京维通利华实验动物科技有限公司，合格证号为SCXK（京）-2016-0011，体重（200±10）g，6~8周龄。温度（24±1）℃、湿度（50±5）%、12 h光照/12 h黑暗、定期通风环境中自由饮水摄食。实验符合3R原则，本研究经本院伦理委员会审核并通过。

2 主要试剂

盐酸DEX注射液（江苏恒瑞医药股份有限公司，批准文号：国药准字H20090248，规格：2 mL；200µg）；FCA（北京梅科万德生物科技有限公司，批号：201850231，规格：10 mL）；TLR4激动剂脂多糖（lipo⁃polysaccharide，LPS；Invivogen，货号tlrl-b5lps）；苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色试剂盒（上海生工生物技术公司，货号E607318）；末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP原位切口末端标记（terminal deoxy⁃nucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end la⁃beling，TUNEL）凋亡试剂盒（上海通善生物科技有限公司，货号Ts-E1001）；抗血管细胞黏附分子1（vas⁃cular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）、TLR4、NF-κB p65、caspase-3、活化的caspase-3（cleaved caspase-3）、核纤层蛋白B（lamin B）和GAPDH抗体（Abcam，货号分别为ab271899、ab13556、ab207297、ab184787、ab214430、ab16048和ab8245）；Cell Counting Kit-8（CCK-8）检测试剂盒和annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒（上海碧云天生物科技有限公司，货号分别为C0037和C1062S）。

3 主要方法

3.1 动物分组及处理 参考文献［8］建立KOA大鼠模型，大鼠备皮与消毒，剃须刀将大鼠右侧前、后膝关节及以下部位毛剃干净，75%乙醇对剃毛部位消毒，消毒完全后使用注射器将0.1 mL FCA注射液注射入膝关节内，分别在第1、3和7天各注射1次，每天强制大鼠活动1 h，7 d后大鼠膝关节出现红肿热痛、同时伴有肿胀现象，周围出现僵硬，膝关节活动受限则为模型建立成功。模型成功30只，随机分为模型组（model group）、DEX组（DEX group）、DEX+TLR4激活剂组（DEX+TLR4 activator group），每组10只。对照组（control group）10只大鼠将FCA注射液换为生理盐水，其余步骤相同。

DEX组鞘内注射100µL/kg DEX［9］，DEX+TLR4激活剂组在DEX组基础上鞘内注射500µg/kg LPS，对照组、模型组相同部位注射等体积生理盐水，每天1次，连续28 d。

3.2 KOA严重程度的评估及膝关节直径的测量在建模前和建模后、给药后均评价关节炎严重程度情况。关节炎的严重程度分级［10］：无肿胀为0分；关节稍红肿为1分；关节轻度红、肿、热为2分；关节中度红、肿、热，出现轻度功能障碍为3分；关节重度红、肿、热，活动受限，不能负重为4分。单个膝关节评分在［0，4］分之间，本研究为2个膝关节评估总分（即KOA评估值）。建模前和建模后、给药后分别用游标卡尺检测大鼠膝关节直径。

3.3 HE染色观察大鼠膝关节滑膜组织的形态 收集各组大鼠膝关节滑膜组织，部分置于4%多聚甲醛中固定48 h，0.5 mol/L脱钙液EDTA（pH 8.0）脱钙12 h，经石蜡包埋后切片（厚度5µm），苏木精染色、伊红复染，中性树胶封片，显微镜下观察膝关节滑膜组织病理变化（包括病理变化和滑膜增生情况）。

3.4 TUNEL染色检测膝关节滑膜组织细胞的凋亡情况 使用TUNEL凋亡试剂盒检测膝关节滑膜组织中细胞凋亡情况。石蜡切片经脱蜡处理，蛋白酶K工作液37℃孵育30 min、DAB显色液显色，中性树胶封片，显微镜下观察、拍照。浓缩棕色DAB沉淀的细胞为TUNEL阳性细胞（即凋亡细胞）。随机选5个视野计数，凋亡指数（%）=TUNEL阳性细胞数/总细胞数×100%。

3.5 大鼠FLS的分离与培养 方法3.3中剩余部分膝关节滑膜组织立即剔除脂肪和纤维，手术剪剪成1 cm×1 cm×1 cm大小组织块，用无Ca2+、Mg2+的DHank’s液轻轻漂洗3次，滑膜组织块平铺在培养瓶中，置在37℃、5%CO2培养箱中贴壁培养2 h，添加含20%胎牛血清的DMEM培养液，继续放置在37℃、5%CO2培养箱中贴壁培养。每天观察，待组织边缘长出较多细胞后去除组织块继续培养，培养期间更换培养液，原代培养细胞成片时传代，待细胞传代3代时，光学显微镜观察细胞形态，并采用抗VCAM-1多克隆抗体鉴定培养细胞是否为FLS。

3.6 FLS的鉴定 细胞置6孔板中，95%的冷乙醇固定细胞30 min，滴加VCAM-1多克隆抗体37℃孵育30 min，滴加FITC标记的Ⅱ抗37℃孵育30 min，荧光显微镜观察细胞形态。

3.7 CCK-8法检测FLS活力 1×107/L FLS接种于96孔板上，每孔100µL，置于37℃、5%CO2培养箱中培养48 h，添加CCK-8试剂，继续培养2 h，酶标仪在450 nm处检测细胞的吸光度（A）值。存活率（%）=实验组（A）值/对照组（A）值×100%。

3.8 Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒检测FLS的凋亡情况 每组1×108/L FLS，经胰酶消化后500 r/min离心5 min收集细胞置于离心管中，加入400µL annexin V结合液悬浮细胞，再加入5µL annexin VFITC染色液4℃避光孵育15 min，加入10µL PI染色液4℃避光孵育5 min。流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

3.9 Western blot检测FLS中TLR4、NF-κB p65、cas⁃pase-3和cleaved caspase-3蛋白水平 细胞浆和细胞核蛋白抽提试剂盒提取细胞浆蛋白和细胞核蛋白（检测NF-κBp65蛋白水平），其余细胞添加蛋白裂解液冰上裂解10 min，10 000 r/min离心10 min，上清为总蛋白（检测其余蛋白水平）。凝胶电泳分离蛋白、PVDF膜转膜，5%脱脂奶粉室温孵育2 h，分别添加对应抗TLR4、NF-κB p65、caspase-3、cleaved caspase-3、lamin B（细胞核蛋白内参照）和GAPDH（其余蛋白内参照）抗体，4℃孵育过夜；加入对应Ⅱ抗，室温孵育1 h。DAB显色试剂盒避光显色，蛋白凝胶成像仪（Tanon，型号：3500）拍照和定量分析。

4 统计学处理

GraphPad Prism 7.0软件对所有数据进行分析。计量数据均采用均数±标准差（mean±SD）表示。多组间比较行单因素方差分析，组间两两比较行SNK-q检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 DEX对大鼠KOA的影响

建模前，各组KOA评估值和膝关节直径差异无统计学显著性（P>0.05）。建模后，与对照组相比，模型组、DEX组和DEX+TLR4激活剂组KOA评估值、膝关节直径升高（P<0.05）。给药后，与对照组相比，模型组、DEX+TLR4激活剂组KOA评估值和膝关节直径及DEX组KOA评估值升高（P<0.05）；与模型组相比，DEX组KOA评估值和膝关节直径及DEX+TLR4激活剂组KOA评估值降低（P<0.05）；与DEX组相比，DEX+TLR4激活剂组KOA评估值和膝关节直径升高（P<0.05）。见表1。

表1 4组大鼠KOA评估值和膝关节直径的比较Table 1.Comparison of KOA evaluation value and knee joint diameter in the 4 groups（Mean±SD.n=10）

2 DEX对大鼠膝关节滑膜组织形态的影响

对照组滑膜组织、滑膜内膜各层次完整，整齐排列；模型组出现大量炎症细胞浸润现象，纤维组织增生、滑膜细胞增生明显，各层次排列紊乱，滑膜组织周围出现较多毛细血管增生现象，呈重度滑膜炎现象；DEX组出现轻度炎症浸润现象，纤维组织、滑膜细胞存在部分增生，排列规则，滑膜组织周围出现微量毛细血管增生现象，呈轻度滑膜炎现象；DEX+TLR4激活剂组呈中度滑膜炎现象。见图1。

Figure 1.Histological changes of knee synovium in the 4 groups（HEstaining，×200）.图1 4组大鼠膝关节滑膜组织形态

3 DEX对大鼠膝关节滑膜组织细胞凋亡的影响

分别与对照组和模型组相比，DEX组和DEX+TLR4激活剂组膝关节滑膜组织细胞凋亡指数升高（P<0.05）；与DEX组相比，DEX+TLR4激活剂组膝关节滑膜组织细胞凋亡指数降低（P<0.05）。见图2、表2。

4 大鼠FLS的鉴定结果

各组细胞分离培养发现，细胞均呈纺锤形，与FLS形态基本一致。免疫荧光细胞化学分析显示，VCAM-1呈阳性表达，即培养细胞为FLS。见图3。

Figure 2.Apoptosis of synovial cells in the knee joint of rats in the 4 groups（TUNEL staining，×200）.图2 4组大鼠膝关节滑膜组织细胞凋亡情况

Figure 3.The morphological changes of FLS（×100）and the expression of its marker protein VCAM-1（cytoimmunofluorescence staining，×200）.图3 FLS的形态及标志蛋白VCAM-1的表达

5 DEX对FLS活力的影响

与对照组相比，模型组、DEX组和DEX+TLR4激活剂组FLS的活力升高（P<0.05）；与模型组相比，DEX组和DEX+TLR4激活剂组FLS活力降低（P<0.05）；与DEX组相比，DEX+TLR4激活剂组FLS活力升高（P<0.05）。见表2。

6 DEX对FLS凋亡的影响

分别与对照组和模型组相比，DEX组和DEX+TLR4激活剂组FLS的凋亡率升高（P<0.05）；与DEX组相比，DEX+TLR4激活剂组FLS的凋亡率降低（P<0.05）。见图4、表2。

表2 4组大鼠膝关节滑膜组织细胞凋亡指数（TUNEL染色）、FLS活力和FLS凋亡率（流式细胞术）的比较Table 2.Comparisons of apoptotic index of synovial tissue cells in knee joint（by TUNEL staining），the viability of FLS，and the apoptotic index of FLS（by flow cytometry）in the 4 groups（%.Mean±SD.n=10）

Figure 4.The representitive images of flow cytometry for analyzing the apoptosis of FLSin 4 groups.图4 4组FLS凋亡情况的流式细胞术图像

7 DEX对FLS中TLR4、NF-κB p65、caspase-3和cleaved caspase-3蛋白水平的影响

与对照组相比，DEX组、DEX+TLR4激活剂组FLS中TLR4、cleaved caspase-3/caspase-3及核内NF-κB p65蛋白水平，模型组FLS中TLR4和核内NF-κB p65蛋白水平升高（P<0.05），模型组、DEX组和DEX+TLR4激活剂组FLS中核外NF-κB p65蛋白水平降低（P<0.05）；与模型组相比，DEX组和DEX+TLR4激活剂组FLS中TLR4和核内NF-κB p65蛋白水平降低（P<0.05），cleaved caspase-3/caspase-3和核外NF-κB p65蛋白水平升高（P<0.05）；与DEX组相比，DEX+TLR4激活剂组FLS中TLR4和核内NF-κB p65蛋白水平升高（P<0.05），cleaved caspase-3/cas⁃pase-3和核外NF-κB p65蛋白水平降低（P<0.05）。见图5、表3。

表3 4组FLS中TLR4、NF-4a p65、caspase-3和cleaved caspase-3蛋白水平的比较Table 3.Comparisons of TLR4，NF-κB p65，caspase-3 and cleaved caspase-3 protein levels in FLSof the 4 groups（Mean±SD.n=10）

Figure 5.The images of Western blot for determining the protein levels of TLR4，NF-κB p65，caspase-3 and cleaved caspase-3 in FLSof the 4 groups.图5 4组FLS中TLR4、NF-κB p65、caspase-3和cleaved caspase-3蛋白水平变化的比较

讨 论

KOA中FLS增殖过度、凋亡不足，滑膜组织增生，表现为FLS类肿瘤样会导致关节局部结构破坏［11］。诱导FLS凋亡能够降低滑膜组织的异常增生，实现对疾病的缓解。DEX在KOA治疗中常作为麻醉药物，用于缓解术后镇痛［12］；随着研究深入，研究发现DEX能够影响细胞凋亡从而影响疾病，为DEX在KOA临床上的应用提供新的理论依据。在本研究中，KOA大鼠评估值升高、膝关节直径增加，膝关节肿胀明显，组织病理切片发现滑膜组织表现出炎症浸润明显、滑膜细胞增生现象明显，各层次紊乱严重，表现出重度滑膜炎现象，提示KOA中滑膜组织损伤严重。经DEX治疗后，KOA大鼠膝关节滑膜组织病理损伤减轻明显，仅出现轻度炎症浸润现象，纤维组织、滑膜细胞存在部分增生，提示DEX能够缓解滑膜细胞过度增生现象，实现对KOA大鼠的保护。进一步TUNEL染色发现DEX治疗后滑膜组织细胞凋亡指数升高，提示DEX可能是通过促进细胞凋亡从而缓解KOA中滑膜细胞的过度生长现象，具体机制尚需进一步研究。

滑膜细胞分为A型滑膜细胞（巨噬细胞样滑膜细胞）和B型滑膜细胞（FLS），在KOA中以FLS为主，约占70%~80%。为验证KOA中FLS发挥的作用，本文提取原代FLS，又因VCAM-1作为FLS分子标记之一，在FLS中大量表达，而在其它成纤维细胞中不表达［13］，因此本研究采用免疫荧光细胞化学染色鉴定FLS，研究发现，细胞呈纺锤形，且VCAM-1呈阳性表达，即提取细胞为FLS，可用于接下来研究。本研究发现，FLS在KOA中生长加快、凋亡差异不明显，提示FLS的异常生长却不凋亡是滑膜组织异常增生的原因之一。

在KOA模型大鼠FLS中TLR4、核内NF-κB p65蛋白水平明显升高，核外NF-κBp65蛋白水平明显降低，提示TLR4/NF-κB在KOA大鼠FLS异常生长中发挥一定作用。而TLR4作为机体重要蛋白质免疫分子，可调控多种非特异性免疫，在KOA中既可以激活机体免疫细胞应答并诱导激发抗微生物防御系统，产生更多炎症因子，炎症因子在NF-κB p65作用下参与疾病免疫过程［14］；又可以影响细胞凋亡，从而影响疾病［15］，在KOA中抑制TLR4的表达能够缓解疾病，实现对滑膜细胞异常增生的缓解［16］。NF-κB p65作为广泛存在于哺乳动物细胞中的转录因子，参与多种基因调控过程，作为TLR4下游调控因子，能够由胞质转位到核内，刺激各种细胞因子等的表达［17］。TLR4/NF-κB通路与细胞凋亡关系密切，荔枝核总黄酮在大鼠肝星状细胞中抑制细胞增殖、促进细胞凋亡与抑制TLR4/NF-κB通路激活关系密切［18］。caspase-3作为促凋亡因子，在KOA中研究发现，抑制凋亡相关蛋白caspase-1和caspase-3等的活化可抑制KOA的发生［19］。此外，DEX能够抑制炎症通路TLR4/NF-κB的表达，实现对KOA的缓解［20］。在本研究中，经DEX治疗后KOA大鼠FLS存活率及细胞中TLR4、核内NF-κBp65蛋白水平降低，凋亡率及细胞中核外NF-κB p65、cleaved caspase-3蛋白水平升高；在DEX基础上添加TLR4激活剂LPS后，大鼠膝关节滑膜组织炎症浸润程度加重，且滑膜组织细胞凋亡指数及FLS凋亡率降低，提示DEX抑制TLR4/NF-κB的表达从而促进FLS细胞凋亡，实现对疾病的缓解。

综上所述，DEX通过下调TLR4表达、抑制NF-κB核移位从而促进KOA中FLS凋亡，从而缓解滑膜组织异常增生，实现对疾病的保护，为DEX在KOA中应用提供新的依据。TLR4/NF-κB通路与炎症关系密切，但在本研究中尚未做炎症相关的探讨，接下来这将作为研究重点深入探究。