醉茄素A通过调节自噬缓解心肌细胞缺血/再灌注（缺氧/复氧）损伤*

郭 蕊， 宋慧芳， 康 毅

（山西医科大学1形态学实验室，2人体解剖学教研室，山西太原030001；3山西省肿瘤医院消化二科，山西太原030013）

最新版中国心血管病报告指出中国心血管病现患人数已达3.3亿，目前死亡率居首位高于肿瘤和其他疾病［1］。心肌梗死（myocardial infarction）在心血管疾病中是致死率较高的疾病，迅速解除梗阻恢复血液灌流是降低心梗损伤的有效策略，但研究发现血液复灌常常伴随心肌组织进一步损伤［2-3］。寻找有效药物，降低心肌缺血/再灌注（myocardiac ischemia/reperfusion，MI/R）损伤，在心梗患者治疗中具有重要临床意义。

醉茄素A（withaferin A，WFA）是从醉茄中提取的主要有效成分，具有免疫调节、抗氧化、降血糖、抗肿瘤及治疗COVID-19等功效［4-6］。本课题组前期研究发现，低浓度WFA可降低心肌缺血再灌注损伤［7-8］，但具体调节机制尚不明确。近年来，细胞自噬在MI/R中的作用受到广泛研究。最新研究提示，自噬流受阻是造成再灌注损伤的关键［9-10］。本研究观察自噬在WFA缓解MI/R损伤中的变化，探讨自噬在此过程中的调节作用，为阐明WFA心血管保护机制提供基础研究数据。

材料和方法

1 H9C2细胞体外培养

H9C2细胞购自中国科学院细胞库。按照标准细胞操作流程，用含10%胎牛血清的DMEM培养液培养，即为对照（control）组。缺氧/复氧（即模拟缺血/再灌注，simulated ischemia/reperfusion，SI/R）组的细胞用含有酚红的Hanks液，置于低氧（1%O2）培养箱中培养3 h后，更换成正常培养液，在普通培养箱中继续培养6 h。WFA治疗（WFA+SI/R）组在SI/R处理前30 min用WFA（终浓度为150 nmol/L）处理细胞。氯喹（chloroquine，CQ）预处理（CQ+WFA+SI/R）组在SI/R处理前1 h用CQ（终浓度为10µmol/L）处理细胞。

2 实验动物

2.1 实验动物及分组 8周龄雄性C57BL/6小鼠由山西医科大学实验动物中心提供，许可证号为SCXK（晋）2015-0001。小鼠随机分为假手术（sham）组、MI/R组、WFA治疗（WFA+MI/R）组和CQ预处理（CQ+WFA+MI/R）组。

2.2 MI/R模型的制备及给药 将小鼠心脏冠状动脉左前降支结扎，缺血30 min后打开结扎线，再灌注3或12 h（分离再灌注3 h小鼠心脏组织，用于TUNEL染色，再灌注12 h的小鼠用于超声成像以检测左心室功能），造成MI/R损伤。假手术组除了只穿线不结扎外，其余的步骤均与MI/R组相同。WFA治疗组于术前1.5 h腹腔注射1 mg/kg WFA，非治疗组注射等体积药物溶剂。CQ预处理组手术前两天腹腔注射60 mg/kg CQ溶液，连续注射2 d，非预处理组注射等体积药物溶剂。

3 主要方法

3.1 Western blot检测蛋白水平 用含有蛋白酶抑制剂的裂解液提取总蛋白，采用Bradford法测量蛋白浓度。蛋白变性后，恒压SDS-PAGE，半干法转膜（PVDF膜）。5%脱脂牛奶封闭1 h，Ⅰ抗4℃孵育过夜，Ⅱ抗室温孵育1 h，每一步孵育后均使用TBST洗膜15 min×3次。ECL发光检测，用ImageJ软件测量图像灰度值进行分析。

3.2 mRFP-GFP-LC3双荧光染色 12孔板接种H9C2细胞，细胞接种量每孔5×104个。次日细胞贴壁后，使用Lipo8000TM转染试剂（碧云天），按照说明转染mRFP-GFP-LC3质粒，转染48 h后，按照分组处理细胞，荧光显微镜拍照。

3.3 CCK-8试剂盒检测细胞活力 96孔板接种H9C2细胞，细胞接种量每孔5 000个，细胞贴壁后按照实验分组进行处理后依照试剂盒说明书操作，酶标仪于450 nm波长检测吸光度（A），根据A值计算相对细胞活力。

3.4 caspase-3活性的检测 裂解液按常规流程裂解细胞后，按照caspase-3活性检测试剂盒说明书操作，测量样品中caspase-3活性，另取少量细胞裂解液测量蛋白浓度，计算相同单位质量蛋白中所含cas⁃pase-3的活性单位。

3.5 TUNEL染色 心脏经固定、脱水制作石蜡切片，脱蜡处理后按照试剂盒说明进行TUNEL染色，DAPI复染细胞核，荧光显微镜采集图像并分析。

3.6 超声检测左心室功能 经1%~2%异氟醚麻醉后，小鼠维持稳定麻醉状态。将超声探头（Vevo 2100，MS-550D）置于小鼠左侧胸前，调节探头位置和角度寻找两侧乳头肌短轴平面，M模式下连续记录3个收缩循环周期的左心室多普勒图像，用于分析左心室射血分数（left ventricular ejection fraction，LVEF）和左心室短轴缩短率（left ventricular fraction shortening，LVFS）。

4 统计学处理

数据由SPSS 23软件进行统计分析。所有的计量资料数据采用均数±标准差（mean±SD）表示。组间均数比较采用单因素方差分析，随后用Bonferroni校正的t检验进行两两比较。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 WFA在缺氧/复氧损伤中对H9C2细胞自噬的调节

Western blot结果显示，与对照组相比，H9C2细胞SI/R损伤后LC3-II/LC3-I、beclin-1、p62和溶酶体相关膜蛋白2（lysosome-associated membrane protein-2，Lamp-2）水平显著升高（P<0.05或P<0.01）；而与SI/R组相比，WFA治疗组LC3-II/LC3-I、beclin-1和p62水平显著降低（P<0.05），Lamp-2表达水平显著升高（P<0.05），见图1。

Figure 1.The effect of withaferin A（WFA）on autophagy-related protein levels in the H9C2 cells with simulated ischemia/reperfu⁃sion（SI/R）injury.Mean±SD.n=3.#P<0.05 vs control group；*P<0.05 vs SI/Rgroup.图1 醉茄素A对缺氧/复氧损伤H9C2细胞自噬水平的影响

mRFP-GFP-LC3质粒转染细胞显示，SI/R组自噬溶酶体红色荧光增多，WFA治疗组与SI/R组相比红色荧光减少，见图2。

2 加入CQ后H9C2细胞自噬指标的变化

CQ预处理并不影响beclin-1、p62和Lamp-2蛋白的基础表达水平；但与单纯SI/R组相比，CQ+SI/R组p62和Lamp-2表达水平显著升高（P<0.05或P<0.01），beclin-1的差异无统计学显著性（P>0.05）；而与WFA+SI/R组相比，CQ+WFA+SI/R组beclin-1、p62和Lamp-2表达水平均显著升高（P<0.01），见图3。

3 加入CQ后H9C2细胞活力和凋亡的变化

离体培养细胞实验证实，CQ预处理可显著抑制WFA组对自噬水平的降低作用，CQ预处理组LC3-II/LC3-I比值显著高于WFA治疗组（P<0.01），见图4A；H9C2细胞活力显著低于WFA治疗组（P<0.01），见图4B；CQ预处理组H9C2细胞cleaved caspase-3的蛋白水平和caspase-3活性显著高于WFA治疗组（P<0.001），见图4C、D。

4 CQ对WFA心功能保护作用的影响

心脏超声结果显示，CQ预处理组LVEF和LVFS显著低于WFA治疗组（P<0.01），见图5A；心肌组织TUNEL染色结果显示，CQ预处理组心肌细胞凋亡率显著高于WFA治疗组（P<0.01），见图5B。

讨 论

急性心肌梗死是冠状动脉急性、持续性缺血缺氧所引起的心肌坏死，是心脏疾病中引起患者死亡最常见的病因之一。急性冠脉综合征的标准治疗方案是最短时间内恢复冠脉血液供应。尽管缺血区心肌恢复血液供应可以缓解心肌坏死，但也伴随着缺血区域的损伤加重［11］。临床治疗中，寻找有效的方式缓解再灌注损伤是本领域多年来研究热点。WFA是醉茄中提取的生物活性成分，研究发现其具有提高免疫力、抗氧化应激和抑制肿瘤生长等作用。本研究发现，WFA在MI/R损伤下可显著增强左心室收缩和舒张能力，改善心功能。

自噬是真核生物保守的细胞内成分降解-再循环的过程，在维持心脏正常代谢、损伤修复时起重要作用［12］。尽管自噬在MI/R损伤中的作用仍存在争议，但最新的研究发现自噬流的形成或降低异常在MI/R损伤过程中起着重要的调节作用［10，13］。自噬主要包括自噬体形成、自噬体与溶酶体融合继而降解等主要过程，生理状态下自噬处于动态平衡，而病理状态下任何环节改变均可能打破自噬平衡，引起细胞和组织器官的功能紊乱［14-15］。本研究结果显示，与control组相比，SI/R组LC3-II/LC3-I比值升高，提示自噬水平升高。与SI/R组相比，WFA治疗组LC3-II/LC3-I比值和p62表达降低，而Lamp-2表达显著升高，提示WFA有效抑制了SI/R引起的自噬水平升高。CQ是自噬体与溶酶体融合的抑制剂。本研究发现，与WFA治疗组相比，CQ预处理组LC3-II/LC3-I比值和p62蛋白表达水平显著升高，心肌细胞凋亡率显著升高，细胞活力显著降低；在体研究结果显示，CQ预处理组心功能显著低于WFA治疗组。以上结果提示，WFA主要是通过促进自噬体与溶酶体融合，降低过高的自噬水平，维持自噬流通畅，进而减少心肌细胞凋亡，改善MI/R损伤后心功能。

Figure 2.The effect of withaferin A（WFA）on LC3 level in the H9C2 cells with simulated ischemia/reperfusion（SI/R）injury（mRFP-GFP-LC3 dual-fluorescence staining，×200）.图2 醉茄素A对缺氧/复氧损伤H9C2细胞LC3水平的影响

Figure 3.The effect of withaferin A（WFA）on autophagy-related protein levels in the H9C2 cells with simulated ischemia/reperfu⁃sion（SI/R）injury after chloroquine（CQ）pretreatment.Mean±SD.n=3.*P<0.05，**P<0.01 vs SI/R group；#P<0.05，##P<0.01 vs WFA+SI/Rgroup.图3 氯喹预处理后醉茄素A对缺氧/复氧损伤H9C2细胞自噬水平的影响

Figure 4.The effect of withaferin A（WFA）on autophagy（A），viability（B）and apoptosis（Cand D）of the H9C2 cells with simu⁃lated ischemia/reperfusion（SI/R）injury after chloroquine（CQ）pretreatment.Mean±SD.n=3.*P<0.05，**P<0.01 vs SI/Rgroup；#P<0.05，##P<0.01 vs WFA+SI/Rgroup.图4 氯喹预处理后醉茄素A对缺氧/复氧损伤H9C2细胞自噬、活力和凋亡的影响

Figure 5.The effect of withaferin A（WFA）on cardiac function（A）and myocardial apoptosis（B，×100）in the mice with myocar⁃dial ischemia/reperfusion（MI/R）injury after chloroquine（CQ）pretreatment.Mean±SD.n=7~10.*P<0.05，**P<0.01 vs vehicle+MI/R group；#P<0.05，##P<0.01 vs WFA+MI/R group.图5 氯喹预处理后醉茄素A对心肌缺血/再灌注损伤小鼠心功能和心肌细胞凋亡的影响

综上所述，本研究证实WFA通过促进自噬体与溶酶体融合，保持自噬流通畅，抑制由缺血/再灌注导致的自噬水平升高，进而缓解缺血/再灌注引起的心肌组织损伤。这一结果将为今后临床治疗的新药研发提供一定的实验数据。