胃癌组织Rap1GAP、HHLA2表达变化及其与患者临床病理特征和预后的关系

王东琴，张欣，霍浩然，秦瑞峰，袁增江

邯郸市中心医院普外科，河北邯郸056000

胃癌是全球范围内常见的恶性肿瘤之一，每年新发病例约99万例、死亡病例约73万例［1］。我国是胃癌的高发国家之一，据统计，我国每年胃癌新发病例占全球的一半左右［2］，并且许多患者就诊时已属进展期，预后较差，5年生存率较低。胃癌的发病机制非常复杂，涉及多种原癌基因和（或）抑癌基因突变、生长因子及其受体异常表达等，但其确切的发病机制仍不十分清楚。Rap1 GTP酶激活蛋白（Rap1-GAP）是GTP酶激活蛋白家族中的一员，能够通过负性调控Rap1活性抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移等［3］。有研究报道，Rap1GAP在乳腺癌、胰腺癌、胶质瘤等组织中表达下调，其表达下调能够促进肿瘤细胞的增殖和侵袭［3-5］。人内源性逆转录病毒-H长末端重复关联蛋白2（HHLA2）是新发现的B7家族成员，具有免疫监视、辅助T细胞激活、维持免疫环境稳定等作用。有研究发现，HHLA2在多种恶性肿瘤组织中高表达，其高表达能够促进肿瘤免疫逃逸，从而导致肿瘤侵袭和转移［6-7］。但目前Rap1GAP、HHLA2表达与胃癌发生、发展的关系尚不清楚。2015年8月—2017年9月，本研究观察了胃癌组织Rap1GAP、HHLA2 mRNA表达变化，并探讨其表达与患者临床病理特征和预后的关系。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 同期选择邯郸市中心医院收治的胃癌患者97例。所有患者符合胃癌临床诊断标准，并经术后组织病理检查明确诊断。纳入标准：①符合胃癌诊断标准；②具有胃癌根治性手术适应证，自愿接受胃癌根治术；③初诊，术前未接受任何抗肿瘤治疗；④临床病理资料和术后随访资料完整。排除标准：①伴有胃肉芽肿、胃结核、胃狭窄等其他胃部疾病者；②既往有胃部手术史者；③合并其他部位恶性肿瘤者；④合并心、肝、肾等重要脏器严重功能不全者。其中，男52例、女45例，年龄51～73（58.79±5.62）岁，肿瘤直径2～6（3.42±0.39）cm；组织分化程度：高分化42例，低中分化55例；浸润深度：T1、2期39例，T3、4期58例；TNM分期：Ⅰ、Ⅱ期38例，Ⅲ、Ⅳ期59例；有淋巴结转移29例，无淋巴结转移68例。本研究经邯郸市中心医院医学伦理委员会批准（审批编号：H20201012006），患者或其家属知情同意并签属知情同意书。

1.2 Rap1GAP、HHLA2 mRNA表达检测 采用RTqPCR法。取胃癌组织及其配对的癌旁组织（距肿瘤组织边缘5 cm以上，并经组织病理检查证实为正常胃组织）各约100 mg，匀浆器中充分研磨，离心后弃上清液。剩余沉淀采用TRIzol法提取总RNA，经紫外可见分光光度计鉴定，OD260/OD280为1.8～2.0。按M-MLV逆转录酶说明将总RNA逆转录为cDNA。逆转录条件：50℃45 min，85℃5 min。以cDNA为模板，按荧光定量PCR扩增检测试剂盒说明进行PCR扩增。所有引物由赛默飞世尔科技（中国）有限公司设计合成。引物序列：Rap1GAP上游引物5′-GCACTTTCTCGGCAAGGAGCATTT-3′，下 游 引 物5′-TGACATCATGGTATGTCCGGCACT-3′；HHLA2上游引物5′-TACAAAGGCAGTGACCATTTGG-3′，下游引物5′-AGGTGTAAATTCCTTCGTCCAGA-3′；GAPDH上 游 引 物5′-TGACGTGCCGCCTGGAGA⁃AAC-3′，下游引物5′-CCGGGCATCGAAGGTG⁃GAAGAG-3′。PCR反应体系共25μL：cDNA模板2μL，2 mmol/L MgCl22μL，2.5 mmol/L dNTP 1.6μL，1 mmol/L上下游引物各0.6μL，800 U/L EX TaqHS DNA聚合酶1μL，1×PCR缓冲液17.2μL；反应条件：95℃2 min，95℃30 s、52℃30 s、72℃45 s共35个循环，最后72℃10 min。扩增反应结束后进行熔解曲线分析，以GAPDH为内参，采用2-ΔΔCt法计算Rap1GAP、HHLA2 mRNA相对表达量。所有操作于CFX96实时荧光定量PCR仪上完成。

1.3 随访 所有患者出院后采用门诊复查或电话形式定期随访，每3个月随访1次。随访截至2020年9月30日。统计随访期间患者因肿瘤死亡情况，计算5年生存率。

1.4 统计学方法 采用SPSS25.0统计软件。计量资料经K-S检验符合正态分布，以±s表示，结果比较采用独立样本t检验。生存分析采用Kaplan-Meier法，生存率比较采用Log-Rank检验。危险因素分析采用Cox风险比例回归模型。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胃癌组织与癌旁正常组织Rap1GAP、HHLA2 mRNA表达比较 胃癌组织Rap1GAP、HHLA2 mRNA相对表达量分别为0.32±0.08、1.03±0.21，癌旁正常组织分别为0.86±0.21、0.42±0.09。胃癌组织Rap1GAP mRNA相对表达量低于癌旁正常组织，HHLA2 mRNA相对表达量高于癌旁正常组织（t分别为22.866、18.612，P均<0.05）。

2.2 胃癌组织Rap1GAP、HHLA2 mRNA表达与患者临床病理特征的关系 见表1。

2.3 Rap1GAP、HHLA2 mRNA表达与胃癌患者预后的关系 97例胃癌患者全部获得随访，随访截至2020年9月30日，死亡43例，无失访病例。以Rap1GAP mRNA相对表达量的中位数（0.30）为截断值，将患者分为Rap1GAP mRNA高表达者（≥0.30，46例）与低表达者（<0.30，51例）；以HHLA2 mRNA相对表达量的中位数（1.01）为截断值，将患者分为HHLA2 mRNA高表达者（≥1.01，50例）与低表达者（<1.01，47例）。Rap1GAP mRNA低表达者5年生存率为37.25%（19/51），Rap1-GAP mRNA高 表 达 者 为76.09%（35/46）；HHLA2 mRNA高表达者5年生存率为44.00%（22/50），HHLA2 mRNA低 表 达 者 为68.09%（32/47）。Rap1GAP mRNA低表达者5年生存率低于Rap1GAP mRNA高表达者，HHLA2 mRNA高表达者5年生存率低于HHLA2 mRNA低表达者（χ2分别为13.831、6.098，P均<0.05）。

2.4 胃癌患者预后不良的危险因素分析 以随访截至日期胃癌患者生存情况为因变量（存活=0，死亡=1），以性别（男=1，女=2）、年龄（连续变量）、肿瘤直径（≥3 cm=1，<3 cm=2）、TNM分期（Ⅰ、Ⅱ期=1，Ⅲ、Ⅳ期=2）、浸润深度（T1、2期=1，T3、4期=2）、组织分化程度（低中分化=1，高分化=2）、淋巴结转移（是=1，否=2）、Rap1GAP mRNA表达（连续变量）、HHLA2 mRNA表达（连续变量）为自变量，纳入Cox风险比例回归模型。单因素Cox风险比例回归分析显示，TNM分期、组织分化程度、浸润深度、淋巴结转移、Rap1GAP mRNA表达、HHLA2 mRNA表达可能与胃癌患者预后不良有关（P均<0.05）；多因素Cox风险比例回归分析显示，有淋巴结转移、Rap1-GAP mRNA低表达、HHLA2 mRNA高表达是胃癌患者预后不良的危险因素（P均<0.05）。见表2。

表2 胃癌患者预后不良的Cox风险比例回归分析结果

3 讨论

胃癌是我国乃至全球常见的消化系统恶性肿瘤之一，其病因和发病机制非常复杂，如幽门螺旋杆菌感染、细胞周期相关蛋白异常表达、上皮间质转化、肿瘤免疫逃逸、原癌基因激活和抑癌基因失活等［8-9］，但其确切的发病机制仍不十分清楚。因此，深入探索与胃癌发生、发展相关的分子机制，对寻找有效的分子诊断标志物和治疗靶点具有重要意义。

Rap1GAP是GTP酶激活蛋白家族中的一员，能够负性调控Rap1活性。Rap1属于小分子G蛋白Ras超家族成员之一，具有逆转原癌基因Ras激活突变体引起的细胞形态改变和传递致癌信号两种截然不同的作用，其活性增强可促进肿瘤细胞侵袭和迁移［10］。Rap1GAP编码的蛋白酶可将Rap1与GTP结合的活化形式催化转变为Rap1与GDP结合的失活形式，从而影响真核细胞的增殖、黏附和迁移等生物学行为［11］。在恶性肿瘤组织中，Rap1GAP mRNA扮演抑癌基因角色。SHAH等［3］研究报道，Rap1GAP表达下调可促使乳腺导管原位癌细胞的细胞外信号调节激酶/有丝分裂原活化蛋白激酶激活，诱导广泛的细胞骨架重组和间充质表型转换，从而增强肿瘤细胞的侵袭性。GAO等［12］研究发现，结直肠癌组织Rap1GAP表达下调，并且其表达下调与肿瘤浸润深度、淋巴结转移和患者预后不良有关。但目前Rap1GAP在胃癌发生、发展中的作用尚不十分清楚。本研究结果发现，胃癌组织Rap1GAP mRNA相对表达量明显低于癌旁正常组织，并且其低表达与肿瘤浸润深度、TNM分期和淋巴结转移有关，提示Rap1GAP mRNA低表达可增强胃癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力，从而导致病情进展和患者预后不良，与高卫利等［13］报道一致。

表1胃癌组织Rap1GAP、HHLA2 mRNA表达与患者临床病理特征的关系

B7家族是一组具有免疫球蛋白结构特征的糖蛋白，其胞外域与IgV、IgC结构域具有同源性。共刺激信号是T细胞抗原特异性激活所必需的，当共刺激信号缺乏时，T细胞在识别抗原后不能有效增殖，无法产生免疫应答，而B7家族成员则成为共刺激信号的主要来源［14］。HHLA2是新发现的B7家族成员，作为T细胞负性共刺激分子，主要表达于人抗原呈递细胞和T细胞，亦可表达于树突状细胞、巨噬细胞及B细胞，可为效应T细胞对肿瘤反应提供免疫监视，还能为记忆T细胞激活提供良好的免疫环境［15］。HHLA2在人体正常组织中极少表达，而在肺、卵巢、肝、食道等恶性肿瘤组织中高表达。JING等［6］研究报道，HHLA2在肝内胆管癌组织中表达明显升高，并且其表达与肿瘤浸润淋巴细胞水平密切相关。CHENG等［16］研究发现，HHLA2在非小细胞肺癌组织中广泛表达，并与肺腺癌EGFR突变和肿瘤浸润淋巴细胞增加有关。但HHLA2在胃癌发生、发展中的作用尚不十分清楚。本研究结果发现，胃癌组织HHLA2 mRNA相对表达量明显高于癌旁正常组织，并且其高表达与肿瘤浸润深度、TNM分期、淋巴结转移有关，提示HHLA2 mRNA能够参与胃癌细胞的增殖、侵袭和迁移，其机制可能与HHLA2 mRNA过表达能够抑制T细胞增殖，诱导肿瘤细胞逃避T细胞的杀伤作用，从而导致肿瘤细胞逃避免疫监视有关［17-18］。

本研究结果还发现，Rap1GAP mRNA低表达者5年生存率低于Rap1GAP mRNA高表达者，HHLA2 mRNA高表达者5年生存率低于HHLA2 mRNA低表达者；Cox风险比例回归分析显示，Rap1GAP mRNA低表达、HHLA2 mRNA高表达是胃癌患者预后不良的危险因素。结果提示，Rap1GAP、HHLA2 mRNA表达可作为胃癌预后评估的生物标志物。

综上所述，胃癌组织Rap1GAP低表达、HHLA2高表达，二者异常表达与胃癌恶性生物学行为和患者预后不良有关。Rap1GAP、HHLA2 mRNA有可能成为胃癌预后评估的生物标志物和潜在的治疗靶点。