食管癌组织lncRNA PCAT-1、ANXA10表达变化及其临床意义

蒲高祥，姚阳

遂宁市中心医院肿瘤科，四川遂宁629000

食管癌是一种原发于食管上皮细胞的恶性肿瘤，在我国具有较高的发病率和病死率［1］。食管癌的发生与癌基因激活和抑癌基因失活密切相关，但其确切的发病机制尚不完全清楚。因此，探索食管癌发病的分子机制，对其早期诊断和靶向治疗具有重要意义。长链非编码RNA（lncRNA）是一类转录本长度超过200 nt的RNA分子，能够参与细胞增殖、凋亡等生物学过程。前列腺癌相关转录因子1（PCAT-1）是lncRNA家族成员之一，定位于人染色体8q24上，能够参与染色体重构、脂质代谢及细胞有丝分裂等过程，还能促进肿瘤细胞增殖和侵袭［2］。有研究发现，PCAT-1通过结合其靶基因PRC2阻碍抑癌基因BRCA2表达，从而使DNA修复和基因重组能力减弱，最终导致前列腺癌的发生风险增加［3］。由此推测，PCAT-1在前列腺癌的发病过程中可能起原癌基因作用。膜联蛋白A10（ANXA10）属于Ca2+依赖磷脂结合蛋白，定位于人染色体4q33上，在免疫抑制、细胞增殖、抑制蛋白激酶活性等方面具有重要作用［4］。有研究报道，肝癌细胞ANXA10表达降低，且其表达与甲胎蛋白水平上调、p53基因突变以及肝癌复发有关［5］，提示ANXA10在抑制肝癌的发生、发展过程中具有抑癌基因作用。但目前lncRNA PCAT-1、ANXA10表达与食管癌的关系报道较少。2016年5月—2017年10月，本研究观察了食管癌组织lncRNA PCAT-1、ANXA10表达变化，并探讨其表达与患者临床病理特征和预后的关系。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择同期遂宁市中心医院收治的食管癌患者87例。纳入标准：①符合食管癌诊断标准［6］，并经术后组织病理检查明确诊断；②初诊；③年龄≥18岁；④具备食管癌根治手术指征；⑤既往无放化疗史或食管手术史。排除标准：①合并Barrett食管炎或反流性食管炎者；②伴有其他部位原发性恶性肿瘤者；③肝肾功能失代偿者；④先天性免疫功能异常者。其中，男60例、女27例，年龄42～70（58.21±7.33）岁，酗酒52例；肿 瘤直径：>3 cm 33例，≤3 cm 54例；TNM分期：Ⅰ、Ⅱ期76例，Ⅲ期11例；组织分化程度：低分化8例，中分化38例，高分化41例；有淋巴结转移7例，无淋巴结转移80例。本研究经遂宁市中心医院医学伦理委员会批准（审批文号：2016-0124），患者或其家属知情同意并签属知情同意书。

1.2 lncRNA PCAT-1、ANXA10表达检测 采用实时荧光定量PCR技术。收集术中新鲜获取的食管癌组织及癌旁组织（距肿瘤组织边缘≥5 cm，经组织病理检查证实为正常食管组织），液氮速冻后转运至-80℃冰箱保存，待组织成批。取部分食管癌组织与癌旁正常组织，液氮下充分研磨，采用TRIzol法提取组织总RNA，经紫外可见分光光度计鉴定，OD260/OD280为1.8～2.0。按PrimeScript RT Reagent Kit说明将总RNA反转录为cDNA。反转录条件：42℃60 min，70℃5 min。以cDNA为模板，按SYBR Green PCR Master Mix Kit说明进行PCR扩增。所有引物序列由北京天根生化科技有限公司设计合成。引物序列：lncRNA PCAT-1上游引物5′-TTGTGGAAGCCCCGCAAGGCCTGAA-3′、下游引物5′-TGTGGGGCCTGCACTGGCACTT-3′，内参GAPDH上 游 引 物5′-GTCAACGGATTTGGTCTGTATT-3′、下 游 引 物5′-AGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3′；ANXA10上游引物5′-GAGCAGCTTTCGGATCACTT-3′、下游引物5′-TCATCAGTGCCTACTCCCTTC-3′，内参GAPDH上游引物5′-CCTCTGACTTCAACAGC⁃GACAC-3′、下游引物5′-TCCACCACCCTGTTGCTG⁃TA-3′。PCR扩增体系共20μL：2×SYBR Master Mix 10μL，cDNA模板2μL，上下游引物各0.4μL，dH2O 7.2μL；反应条件：95℃5 min，95℃5 s、60℃20 s、72℃15 s共40个循环。扩增反应结束后进行熔解曲线分析。以GAPDH为内参，采用2-ΔΔCT法计算目的基因相对表达量。实验重复3次，取平均值。

1.3 随访 所有患者出院后以电话或门诊复查形式定期随访，随访截至2020年10月30日，统计患者3年总体生存率。

1.4 统计学方法 采用SPSS22.0统计软件。计量资料经Shapiro-Wilk检验符合正态分布，以±s表示，结果比较采用单因素方差分析或独立样本t检验。相关性分析采用Pearson相关分析法。生存分析采用Kaplan-Meier法，生存率比较采用Log-Rank检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 食管癌组织与癌旁正常组织lncRNA PCAT-1、ANXA10表达比较 食管癌组织lncRNA PCAT-1相对表达量为3.64±1.31，癌旁正常组织为1.22±0.56，食管癌组织lncRNA PCAT-1相对表达量高于癌旁正常组织（t=15.844，P<0.05）；食管癌组织ANXA10相对表达量为0.61±0.23，癌旁正常组织为1.95±0.74，食管癌组织ANXA10相对表达量低于癌旁正常组织（t=16.129，P<0.05）。

2.2 食管癌组织lncRNA PCAT-1、ANXA10表达与患者临床病理特征的关系 见表1。

表1 食管癌组织lncRNA PCAT-1、ANXA10相对表达量与患者临床病理特征的关系

2.3 食管癌组织lncRNA PCAT-1表达与ANXA10表达的关系 Pearson相关分析显示，食管癌组织lncRNA PCAT-1表达与ANXA10表达呈负相关关系（r=-0.757，P<0.05）。

2.4 食管癌组织lncRNA PCAT-1、ANXA10表达与患者预后的关系 至随访截至日期，共随访1～36个月，随访期间死亡37例，无失访病例。以食管癌组织lncRNA PCAT-1相对表达量的中位数（3.63）为临界值，将患者分为lncRNA PCAT-1高表达者（≥3.63，43例）、lncRNA PCAT-1低表达者（<3.63，44例），lncRNA PCAT-1高表达者3年总体生存率为37.21%（16/43），lncRNA PCAT-1低 表 达 者 为59.09%（26/44），lncRNA PCAT-1高表达者3年总体生存率低于lncRNA PCAT-1低表达者（χ2=4.167，P<0.05）。以食管癌组织ANXA10相对表达量的中位数（0.62）为临界值，将患者分为ANXA10高表达者（≥0.62，41例）、ANXA10低表达者（<0.62，46例），ANXA10高表达者3年总体生存率为60.98%（25/41），ANXA10低表达者为36.96%（17/46），ANXA10高表达者3年总体生存率高于ANXA10低表达者（χ2=5.696，P<0.05）。见图1、2。

图1 食管癌组织不同lncRNA PCAT-1表达者生存曲线

图2 食管癌组织不同ANXA10表达者生存曲线

3 讨论

我国是世界上食管癌的高发国家之一，每年因食管癌死亡约15万例，并且男性死亡例数约为女性的2倍［1］。有研究报道，食管癌发生的本质是细胞基因组改变，特别是一些癌基因和抑癌基因改变［7-8］。近年来，随着基因测序技术不断成熟，人们逐渐发现组蛋白修饰、lncRNA、DNA拷贝数改变以及DNA甲基化等能够参与肿瘤细胞的分化和凋亡，影响肿瘤微环境，在肿瘤发生、发展中扮演重要角色［9］。但食管癌发病的确切分子机制仍不完全清楚。

lncRNA是一类转录本长度超过200 nt的RNA分子，由于缺乏有效的开放阅读框，不具备编码蛋白质的功能，过去被认为是转录的副产物。近年随着人们对lncRNA认识的逐步深入，发现lncRNA能够通过调控染色质重构、磷酸化以及miRNA降解等生物学过程，参与细胞增殖、分化、凋亡等生命活动［8］。lncRNA PCAT-1属于Mariner转座子家族，与前列腺癌风险相关的单核苷酸多态性位点毗邻，能够以竞争性结合miRNA的方式调节靶基因表达［10］。有研究表明，miR-218能够通过与lncRNA PCAT-1结合，抑制lncRNA PCAT-1表达，从而使结合物蛋白基因沉默，继而使肝癌细胞增殖速度降低［11］，结果提示lncRNA PCAT-1在肝癌的发生、发展中可能具有促癌基因作用。药物试验表明，食管癌组织lncRNA PCAT-1基因沉默后肿瘤细胞增殖能力明显减弱，同时其对顺铂的耐药性明显降低［12］。本研究结果发现，食管癌组织lncRNA PCAT-1高表达，并且其表达与肿瘤TNM分期和淋巴结转移有关。提示lncRNA PCAT-1可能参与食管癌的发生、发展，其机制可能为食管癌组织原癌基因c-Myc表达上调，而c-Myc是lncRNA PCAT-1的上游基因，能够结合lncRNA PCAT-1的Alu序列，使其启动子激活，从而使lncRNA PCAT-1表 达 上 调［10］。有 研 究 亦 发 现，lncRNA PCAT-1表达上调能够激活Cyclin B、Cyclin E、Cyclin D1等细胞周期蛋白，使G0/G1期肿瘤细胞数量降低，而S期肿瘤细胞数量增加，加速细胞周期循环，从而导致肿瘤细胞分裂和分化能力增强［13-14］。此外，lncRNA PCAT-1高表达还能促进基质金属蛋白酶2、基质金属蛋白酶9表达，使Snial基因活化，从而促进上皮间质转化，使肿瘤细胞易于侵袭和迁移［12］。

ANXA10属于Annexins家族成员，其C末端能够结合Ca2+和磷脂形成空间三级结构，而N末端在与其他蛋白结合后能够决定其相应的生物学功能［4］。Annexins家族是重要的膜功能蛋白，在胞吞、胞吐、Ca2+信号传导、抗凝、细胞分裂和分化、血管生成以及免疫抑制等方面具有重要的调控作用［15-16］。有研究发现，上调ANXA10表达能够抑制肝癌细胞增殖和分化，并且其表达变化与肝癌临床分期、组织分化程度和患者预后呈负相关［17］。既往研究发现，ANXA10能够抑制钙结合蛋白S100A4表达，而S100A4是肿瘤侵袭和转移的重要诱导剂之一，其表达下调能够阻碍肿瘤进展［15］，表明ANXA10在细胞癌变过程中具有抑制作用。本研究结果发现，食管癌组织ANXA10相对表达量降低，并且其表达与肿瘤TNM分期和淋巴结转移有关，结果提示ANXA10可能在食管癌的发生、发展中具有抑制作用，其机制可能为ANXA10转录基因甲基化，使其染色质结构和DNA构象发生改变，从而导致ANXA10转录基因沉默，继而引起ANXA10表达下调［18］。有研究表明，ANXA10表达下调可导致结合衔接蛋白Grb2能力减弱，从而使ERK/MAPK信号通路活化，肿瘤细胞释放大量生长因子，并促进肿瘤细胞分裂，加速肿瘤细胞增殖和迁移［15-16］。此外，ANXA10表达下调对钙结合蛋白S100A4的抑制能力减弱，而活化的S100A4能够结合晚期糖基化终末产物受体，从而激活NF-κB信号通路，促进肿瘤细胞侵袭和迁移［19］。

本研究结果发现，食管癌组织lncRNA PCAT-1表达与ANXA10表达呈负相关关系，提示lncRNA PCAT-1可能通过结合ANXA10转录基因靶点，使ANXA10蛋白转录受阻，进而导致食管癌侵袭能力增强。有研究表明，lncRNA PCAT-1通过海绵miR-508-3p基因抑制ANXA10表达，从而促进食管癌进展［20］。ZANG等［21］研究认为，ANXA2能够与c-Myc结合，而c-Myc又是lncRNA PCAT-1的靶点基因，表明lncRNA PCAT-1与Annexins家族确实存在一定联系，但其具体机制仍不清楚，尚需进一步研究证实。本研究结果还发现，lncRNA PCAT-1高表达者3年总体生存率低于lncRNA PCAT-1低表达者，ANXA10高表达者3年总体生存率高于ANXA10低表达者，即lncRNA PCAT-1表达上调和ANXA10表达下调时，食管癌患者生存时间明显缩短。结果表明，lncRNA PCAT-1、ANXA10表达变化可能与食管癌患者预后密切相关。

综上所述，食管癌组织lncRNA PCAT-1高表达、ANXA10低表达，二者表达与肿瘤TNM分期、淋巴结转移和患者预后有关。lncRNA PCAT-1、ANXA10有可能成为食管癌早期诊断、靶向治疗和预后评估的生物标志物。