m6A RNA甲基化调节因子与肝细胞癌预后的关系

裴晓健，贾宝学，田晓彤

山东第一医科大学第三附属医院内一科，济南250031

肝细胞癌（HCC）是原发性肝癌中最常见的病理类型，因其早期诊断困难、病情进展迅速，预后较差［1］。迄今为止，HCC的发病机制仍未完全阐明，其演变可能是由遗传学和表观遗传学共同改变所致。N6-甲基腺嘌呤（m6A）是真核生物mRNA中含量最丰富的甲基化修饰形式［2-3］。m6A RNA甲基化类似于DNA甲基化和组蛋白修饰，由“编写器”、“阅读器”和“擦除器”等甲基化调节因子动态调节共同完成［3］。这些m6A RNA甲基化调节因子与肿瘤干细胞自我更新和肿瘤细胞增殖、分化以及放化疗敏感性密切相关［4］。但目前m6A RNA甲基化调节因子在HCC中的作用及其对预后的影响尚未得到证实。为此，本研究观察了m6A RNA甲基化调节因子在HCC中的表达，并探讨其与预后的关系。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 数据下载与资料提取 从美国国家癌症研究所基因组数据共享中心（https：//portal.gdc.cancer.gov/）下载HCC样本和正常对照样本的RNA-seq转录组数据，筛选其FPKM格式数据。同时，收集HCC样本的临床病理资料。排除性别、年龄、WHO病理分期、病理分级等临床病理资料不完整样本。

1.2 筛选m6A RNA甲基化调节因子 十三种m6A相关基因被认为是m6A RNA甲基化调节因子［5］，并且在胶质瘤中被证实［6］，但在HCC中尚未被证实。从RNA-seq转录组数据中获取十三种m6A RNA甲基化调节因子表达数据，比较HCC样本和正常对照样本m6A RNA甲基化调节因子表达。

1.3 十三种m6A RNA甲基化调节因子的相互作用 应用STRING数据库构建十三种m6A RNA甲基化调节因子的蛋白质—蛋白质相互作用（PPI）网络，并用R软件中的“corrplot”包分析其相关性。

1.4 预后相关基因筛选 应用R软件中的“survival”包对TCGA数据进行单因素Cox回归分析，筛选与预后相关的基因。应用R软件中的“survival”和“glmnet”包，对筛选的预后相关基因进行Lasso Cox回归分析，进一步明确与预后相关的基因。同时，根据这些预后相关的基因构建HCC预后风险模型。

1.5 基于m6A RNA甲基化调节因子的风险评估 根据m6A RNA甲基化调节因子表达情况，以Lasso Cox回归风险评分为分界值，将HCC患者分为高危者与低危者，比较二者总生存期（OS）。采用受试者工作特征（ROC）曲线［7］检验风险模型的预测效能。采用单因素和多因素Cox回归模型分析风险模型与HCC预后的关系。

2 结果

2.1 HCC样本与正常对照样本十三种m6A RNA甲基化调节因子表达比较 本研究共收集HCC样本374例份、正常对照样本50例份。结果发现，HCC样本FTO、YTHDC2、YTHDC1、ALKBH5、KIAA1429、METTL3、HNRNPC、YTHDF2、RBM15、YTHDF1、WTAP表达均高于正常对照样本（P均<0.01），而两样本METTL14、ZC3H13表达比较差异均无统计学意义（P均>0.05）。见图1。

图1 HCC样本与正常对照样本十三种m6A RNA甲基化调节因子表达的小提琴图

2.2 m6A RNA甲基化调节因子的PPI网络及其相关性分析 十三种m6A RNA甲基化调节因子在HCC的PPI网络中，除RBM15与ZC3H13、ZC3H13与KIAA1429外，6个“编写器”之间存在密切而复杂的相互关系；5个“阅读器”之间的交互较少，但仍能观察到它们之间存在一定相互关系；2个“擦除器”亦存在相互关系。在十三种m6A RNA甲基化调节因子的相互作用中，以METTL13与HNRNPC的相关性最强。见图2、3。

图2 十三种m6A RNA甲基化调节因子的PPI网络

2.3 HCC预后相关基因筛选 单因素Cox回归分析 显 示，YTHDF1、ZC3H13、WTAP、YTHDF2、RBM15、METTL3、HNRNPC、YTHDC1、KIAA1429等九种m6A RNA甲基化调节因子可能与HCC患者OS有 关（P均<0.05），而YTHDC2、METTL14、FTO、ALKBH5等四种m6A RNA甲基化调节因子可能与HCC患者OS无关（P均>0.05）。Lasso Cox回归分析显 示，YTHDF1、ZC3H13、YTHDF2、METTL3、KIAA1429等五种m6A RNA甲基化调节因子是影响HCC预后的危险因素（P均<0.05）。Kaplan-Meier生存分析显示，ZC3H13高表达者预后良好，而YTHDF1、YTHDF2、METTL3、KIAA1429高表达者预后较差，见图4。

图3 十三种m6A RNA甲基化调节因子的相互关系

图4 五种m6A RNA甲基化调节因子的Kaplan-Meier生存曲线

2.4 m6A RNA甲基化调节因子对HCC预后评估的价值 根据YTHDF1、ZC3H13、YTHDF2、METTL3、KIAA1429等五种m6A RNA甲基化调节因子构建HCC预后风险模型，以Lasso Cox回归风险评分作为分界值，将HCC患者分为高风险者与低风险者。结果发现，高风险者5年生存率为40%，低风险者为56%，高风险者5年生存率明显低于低风险者（P<0.05），见图5。绘制风险模型预测HCC预后的ROC曲线，结果发现，该风险模型的ROC曲线下面积为0.619，提示该风险模型预测HCC预后具有一定准确性，见图6。

图5 高风险者与低风险者Kaplan-Meier生存曲线

图6 风险模型预测HCC预后的ROC曲线

2.5 影响HCC预后的危险因素分析 单因素Cox回归分析显示，WHO病理分期、T分期和风险模型评分可能与HCC预后有关（P均<0.05）。多因素Cox回归分析显示，风险模型评分是影响HCC预后的独立危险因素（P<0.01）。见表1、2。

表1 HCC预后相关因素的单因素Cox回归分析结果

3 讨论

肝癌是全球第六大常见恶性肿瘤，具有高发病率、高转移率、高复发率和高病死率的特征。目前，肝癌的确切发病机制尚不完全清楚，除受环境和饮食影响外，还与遗传、基因表达、宿主免疫状态等因素有关［8］，其发病是一个多步骤、多因素参与的复杂生物学过程。迄今为止，临床仍缺乏对肝癌的有效治疗手段。因此，深入探索肝癌的发病机制，对其早期诊断、靶向治疗和预后评估具有重要意义。

表2 HCC预后相关因素的多因素Cox回归分析结果

m6A是真核生物mRNA中含量最丰富的甲基化修饰形式［2-3］。有研究报道，m6A RNA甲基化调节因子在恶性肿瘤的发生、发展过程中具有重要作用［9］。CHEN等［10］研究发现，m6A RNA甲基化调节因子异常表达与肝癌的发生、发展有关。m6A甲基化水平与细胞内“编写器”、“擦除器”和“阅读器”表达密切相关。本研究选择了十三种m6A相关基因［5］，进一步分析了这些m6A RNA甲基化调节因子在HCC中的表达，结果发现除METTL14、ZC3H13外，HCC样本FTO、YTHDC2、YTHDC1、ALKBH5、KIAA1429、METTL3、HNRNPC、YTHDF2、RBM15、YTHDF1、WTAP表达均高于正常对照样本。在PPI网络中发现，除RBM15与ZC3H13、ZC3H13与KIAA1429外，6个“编写器”之间存在密切而复杂的相互关系；5个“阅读器”（HNRNPC、YTHDC2、YTHDC1、YTHDF1和YTHDF2）之间的交互较少，但仍能观察到它们之间存在一定相互关系；2个“擦除器”（FTO和ALKBH5）亦存在相互关系。在这十三种m6A RNA甲基化调节因子的相互作用中，以METTL13与HNRNPC的相关性最强。对这十三种m6A RNA甲基化调节因子进行单因素Cox回归分析发现，YTHDF1、ZC3H13、WTAP、YTHDF2、RBM15、METTL3、HNRNPC、YTHDC1、KIAA1429等九种m6A RNA甲基化调节因子可能与HCC患者OS有关，而YTHDC2、METTL14、FTO、ALKBH5等四种m6A RNA甲基化调节因子可能与HCC患者OS无关。Lasso Cox回归分析发现，YTHDF1、ZC3H13、YTHDF2、METTL3、KIAA1429等五种m6A RNA甲基化调节因子是影响HCC预后的危险因素。Kaplan-Meier生存分析发现，ZC3H13高表达者预后良好，而YTHDF1、YTHDF2、METTL3、KIAA1429高表达者预后较差。本研究进一步选择与预后有关的这五种m6A RNA甲基化调节因子构建了HCC预后评估风险模型，以Lasso Cox回归风险评分作为分界值，将HCC患者分为高风险者与低风险者，高风险者5年生存率明显低于低风险者；绘制该风险模型预测HCC预后的ROC曲线，结果发现，该风险模型预测HCC预后的ROC曲线下面积为0.619，提示该风险模型对HCC预后具有较为可靠的预测价值。ZC3H13是一种经典的CCCH锌指蛋白，定位于人染色体13q14.1。ZHU等［11］研究发现，ZC3H13可通过调控K-Ras、ERK信号表达，抑制大肠癌细胞增殖和侵袭。本研究结果显示，ZC3H13在低风险者中高表达，提示ZC3H13在HCC中可能发挥抑癌基因作用。ZHAO等［12］研究发现，YTHDF1在肝癌组织中高表达，且与患者预后不良显著相关。YTHDF2的主要作用是调节m6A修饰的mRNA降解。最近研究发现，YTHDF2与HCC恶性程度密切相关［13］。本研究结果发现，YTHDF1、YTHDF2在HCC样本和高风险者中高表达，并且与患者预后不良显著相关，提示YTHDF1、YTHDF2在HCC中可能发挥癌基因作用。有研究证实，METTL3介导的m6A修饰能够参与多种恶性肿瘤的发生、发展［14］。KIAA1429可通过调节ID2 mRNA甲基化水平，促进肝癌细胞增殖、侵袭和迁移［15］。有研究报道，KIAA1429在精原细胞瘤［16］和乳腺癌［17］中高表达。本研究结果发现，METTL3、KIAA1429在HCC样本和高风险者中高表达，并且与患者预后不良有关，提示METTL3、KIAA1429在HCC中可能发挥癌基因作用。但由于肿瘤存在异质性，m6A RNA甲基化调节因子在不同肿瘤中的表达及其作用不同。因此，m6A RNA甲基化调节因子的致癌机制还存在争议。综上所述，m6A RNA甲基化调节因子表达与HCC预后密切相关，有可能作为肿瘤诊断的分子标志物和潜在的治疗靶点。但由于本研究对照样本相对较少，HCC样本的某些重要临床病理特征无法直接从TCGA数据库中获得，未来尚需大量临床研究进一步验证。