阿霉素联合头孢噻啶致大鼠慢性肾衰模型的建立及意义

姜洪波,孙利伟*,田玉玲,杜 娟,刘宇奇,王利武,马英伟

(1.长春市儿童医院 精准儿童医学中心,吉林 长春130061；2.吉林省医院 肾病科，吉林 长春130021)

慢性肾脏病(Chronic kidney disease，CKD) 已成为关系全球人类健康的重要疾病之一，全球发病率约为8%-16%[1]。CKD最终的归宿是肾功能衰竭。肾衰的发病机制尚未明确，研究肾衰的发病机制，一直是临床急需解决的问题。本研究应用阿霉素联合头孢噻啶，给大鼠静脉注射或/和肌肉注射，成功建立了大鼠慢性肾功能衰竭动物模型,报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物健康SPF级SD大鼠，6-8周龄，雄性，体重300 g左右，18只，购于重庆恩斯维尔生物科技有限公司。18只动物随机分为正常对照组(A组)和模型B组、C组、D组、E组、F组，共计6组，每组3只大鼠。

1.2 主要仪器设备电子分析天平(Precisa12A)，为瑞士产品；蠕动泵驱动器，保定兰格恒流泵有限公司；显微外科手术器械包(SSW-3型)，上海手术器械厂；纯水仪，德国Millipore产品。

1.3 主要试剂(1)PBS磷酸盐缓冲液。(2)7%水合氯醛，室温避光保存。(3)4%多聚甲醛。(4)5 mg/ml盐酸阿霉素：盐酸阿霉素25 mg，溶于5 ml生理盐水中。(5)20 mg/ml头孢噻啶：头孢噻啶100 mg，溶于5 ml生理盐水中。(6)尿蛋白定量测定试剂盒，肌酐测定试剂盒，尿素氮测定试剂盒，血清钾、钙、磷检测试剂盒，均为南京建成产品。(7)HE染色固定液。(8)阿霉素为meilunbio产品(产品编号：MB1087)、头孢噻啶购自酷尔化学科技有限公司。

1.4 实验方法

1.4.1动物适应性饲养 动物房12 h-12 h昼夜交替，保持动物自由饮水、进食，温度23-25℃，饲养在代谢笼中，实验动物进入动物房适应性饲养1周后进入实验。

1.4.2动物建模 实验鼠称重并麻醉， B、D、E、F组分别按照6.5 mg/kg的剂量给与阿霉素尾静脉注射1次，第2天C、D、E、F组分别按照60 mg/kg、30 mg/kg、50 mg/kg、70 mg/kg的量于后肢大腿外侧肌肉注射头孢噻啶，连续注射3天。A组大鼠给予5ml生理盐水尾静脉注射3天。

1.4.3实验取材 ⓐ尿液取材 将大鼠饲养在代谢笼里，正常提供水和饲料，在完成3天肌注后第3天、7天、14天，收集每只大鼠24 h尿液，用于生化检测。ⓑ血清取材 在肌注后第14天尾静脉取血、28天各组大鼠称重并麻醉，分别取眼眶血和剪开腹腔暴露腹主动脉，用止血钳夹闭腹主动脉近心端将采血针插入腹主动脉，松开止血钳将采血管插在采血针另外一头取血。血液静置1-2 h后离心(3 000转/min，20 min，4℃)，取上层血清用于生化检测。ⓒ肾脏取材 在肌注后第28天各组大鼠称重并麻醉，剪开胸廓暴露心脏，将灌注泵一端针头插入左心室中，并用止血钳固定，剪开右心耳，开放静脉血。首先灌注100 ml-200 ml生理盐水，再灌注4%多聚甲醛200 ml-300 ml固定。灌注后的大鼠将腹腔剪开取出肾脏放于4%多聚甲醛中固定用于HE检测。

1.4.4尿蛋白含量测定 尿液标本应用尿蛋白检测试剂盒进行尿蛋白检测，方法严格按试剂说明书进行。

1.4.5血清肌酐、尿素氮、血清钾、钙、磷含量检测 将采集的血液标本，检测血清肌酐、尿素氮、血清钾、钙、磷含量。检测方法按试剂说明书进行。

1.4.6肾脏病理 分别取A、B、C、D、E、F组大鼠的肾脏组织，进行组织石蜡包埋、石蜡切片、HE染色，光镜下观察肾小球、肾小管间质病理形态学改变。

1.5 统计分析

采用SPSS 25.0 软件。计量资料以均值±标准差表示， 组间比较采用单因素方差分析，应用LSD-t检验进行多重比较。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠尿量及尿蛋白含量变化

2.1.1尿量比较 模型B、C、D、E、F组与正常对照A组比较，用药后第7天和14天尿量均明显增多，经方差分析有统计学意义，(F7天=8.442，P7天=0.001；F14天=47.758，P14天=0.000)。B、C组与D、E、F组比较，在用药后第3天尿量无明显差异；第7天F组尿量较B组(P=0.029)和C组(P=0.014)明显增多，见图1。

图1 大鼠尿量比较

2.1.2尿蛋白量比较 模型B、C、D、E、F组与正常对照A组比较，在用药后第3天、7天、14天尿蛋白量均明显增高；D、E、F组尿蛋白量均值依次增高；经方差分析差异均有统计学意义，见表1。

表1 用药后大鼠尿蛋白量均值(mg/L)的变化

比较各模型组大鼠结束用药后3天、7天、14天尿蛋白量，随着用药时间增多，尿蛋白量也明显增多， B、C组与D、E、F组比较，用药后3天，F组较B组， D、E、F组较C组尿蛋白量增多；用药7天、14天D、E、F组与B、C组尿蛋白量比较均明显增多，有统计学意义。

2.2 各组大鼠用药后血清肌酐、尿素氮变化在用药后第14天和28天取血样检测血清肌酐和尿素氮，模型B、C、D、E、F组大鼠血清肌酐和尿素氮均值均明显升高，与正常对照A组比较，存在明显差异，有统计学意义，见表2。联合用药的D、E、F组与不联合用药的B、C组分别比较，血清肌酐和尿素氮均值亦明显升高，差异有统计学意义。

表2 用药后大鼠血清肌酐(μmol/L)、尿素氮(mmol/L)均值

2.3 各组大鼠用药后血钾、钙、磷含量变化用药后第14天、28天模型B、C、D、E、F组大鼠血钾、血磷增高，血钙降低；联合用药D、E、F组与单独用药的B组、C组分别比较，用药后第14天血钾、血磷增高，血钙降低，有统计学意义；用药后第28天血钾、血磷增高，血钙降低，除血钙B组与D组比较，差异无统计学意义(P血钙=0.106)外，其余各组均有统计学意义。

2.4 各组大鼠肾脏病理改变正常对照组肾形态正常，肾结构比较清晰，肾小球比较规则(图2)；与正常对照组比较，B组(阿霉素6.5 mg/kg组)(图3)、C组(头孢噻啶60 mg/kg组)(图4)肾小球系膜细胞增生，基底膜增厚；阿霉素与头孢噻啶联合作用的D、E、F组的部分肾小球出现分叶状，肾小囊内血浆蛋白渗出，随着头孢噻啶浓度的增加，病变病理改变更加明显，出现肾小管扩张，间质损伤，上皮细胞空泡变性和纤维化；毛细血管袢分辨不清，见图5、6、7。

3 讨论

我国慢性肾脏病(CKD)发病率持续上升[2],明确发病原因和临床表现，进行早期诊断和治疗有重要的意义。CKD表现为进行性和不可逆肾单位特征丧失，肾再生能力降低、微血管损伤、代谢紊乱、氧化应激和炎症反应，最终导致肾组织纤维化[3]。CKD的原因及发病机制多且复杂；临床表现多样，缺乏特异性，主要表现为代谢紊乱，早期症状不明显，当出现明显症状时，病情已经进展，健康的肾单位已经明显减少，进展到衰竭期和尿毒症期。治疗以肾脏透析为主，或进行肾移植。CKD的进展与急性肾损伤(AKI)和反复发作AKI有关(称为AKI到CKD转换)。同样，AKI可以导致CKD的发展[4]。

表3 用药后大鼠血清钾、钙、磷含量

图2 A组HE染色肾脏常规病理 图3 B组HE染色肾脏病理改变

图4 C组HE染色肾脏病理改变 图5 D组HE染色肾脏病理改变

阿霉素为蒽环类抗生素，是细胞毒类抗肿瘤药物。是经典的啮齿类动物肾脏损伤的诱发剂， 能够引发初期肾小球局灶节段性硬化症， 能够很好地模拟人体慢性肾脏损伤过程。1970 年，Sternberg 首次报道蒽环类抗生素能够引起肾炎[5]。阿霉素可损害肾近曲小管上皮细胞，使其脱离，并与管腔内的蛋白质和其他细胞成分融合成管型，堵塞管腔，使肾内压增高，产生损伤[6]。阿霉素肾炎动物模型的典型特征是用药几天之内就发生肾脏的严重损伤， 但损伤发生的时段很稳定，且可以预料，因此动物造模过程中死亡率较低(5%)[7]，造模相对简单，成功率高。

图6 E组HE染色肾脏病理改变 图7 F组HE染色肾脏病理改变

头孢噻啶为头孢菌素类抗菌药物，具有肾毒性，可引起肾损害，正常治疗剂量尿中即有透明管型出现。每日8 g以上，常会造成肾小管坏死，表现为蛋白尿、管型尿和血尿、尿素氮升高等，甚至出现少尿或急性肾功能衰竭[8]。早在1966年，Atkinson就成功建立了头孢菌素肾毒性动物模型[9]。但是，阿霉素联合头孢噻啶制备大鼠慢性肾衰竭的动物模型，目前未见报道。头孢菌素类抗生素在临床被广泛应用，与其他药物联合应用亦较常见；国内外均有相关副作用的报道[10-12]。

本研究成功制备了阿霉素联合头孢噻啶致大鼠慢性肾衰竭的模型，并与单独应用阿霉素和头孢噻啶药物建立的大鼠慢性肾衰竭模型进行比较。模型组与对照组大鼠比较，在造模过程中尿量、尿蛋白量明显增多；肌酐和尿素氮明显增多；血钾和血磷明显增高；血钙降低；均有统计学意义(P<0.05)。联合用药组与单独用药组比较，在造模过程中代谢紊乱更加明显，表现为尿量增多、尿蛋白升高，血肌酐、尿素氮、血钾、血磷升高，血钙降低。慢性肾功能衰竭病理演化过程是多种因素引起肾小球和肾小管的损伤，持续损伤造成肾组织萎缩、纤维化[13]。本研究模型组肾小球出现不同程度萎缩硬化的表现。联合用药组出现明显的肾小管病变，出现肾小管扩张，间质损伤，上皮细胞空泡变性和纤维化；毛细血管袢分辨不清等病理损伤。

本研究建立的阿霉素联合头孢噻啶大鼠CKD模型。阿霉素用药量较少，避免了对心脏等重要脏器的损伤作用而导致动物早期死亡，实验失败情况的发生。阿霉素联合头孢噻啶大鼠CKD模型，造模方法简单，肾脏病理损伤明显，接近慢性肾衰的临床实际。是研究慢性肾功能衰竭发生机制、病理损害及药物干预等的理想实验动物模型。