1例Noonan综合征的产前诊断与遗传学分析

耿 茜，刘 洋，吴维青，张 瑚，谢建生

(南方医科大学附属深圳市妇幼保健院 医学遗传中心,广东 深圳518028)

Noonan 综合征(Noonan Syndrome,NS)是一种常染色体显性遗传病，活产新生儿中的发病率为1/1000-1/2500[1-2]，临床主要以特殊面容、身材矮小、先天性心脏病等为特征，可累及多个系统。已明确的与NS相关的基因有：PTPN11，KRAS,SOS1,BRAF,RAF1,MAP2K1,NRAS,SHOC2,CBL[3-5]。由于Noonan 综合征较高的临床及遗传异质性，NS诊断、特别是产前诊断一直相对困难。国内尚未见NS产前的相关报道。我们追踪1例孕早期发现颈部透明层(nuchal translucency,NT)增厚的胎儿，综合分析其临床各项检查结果，应用芯片捕获高通量测序检测出胎儿RAF1基因新发突变，报告如下。

1 资料与方法

1.1 研究对象

孕妇，G1P0，27岁。否认疾病家族史及近亲结婚史。孕妇无放射性物质接触史，无药物服用史。孕12周于深圳市妇幼保健院产检B超示NT：6.7 mm。孕17周3天行羊水穿刺术，G显带染色体核型分析及染色体微阵列分析(chromosomal microarray analysis,CMA)均未见异常。孕23周Ⅲ级超声检查示：单胎，胎儿头位；胎头双顶径长 5.5 cm，头围19.73 cm，腹围19.36 cm；胎儿多发畸形：颈部水囊瘤，小下颌，前额软组织增厚，双肾盂轻度分离，足跟声像改变。孕27周B超示：颈部水囊瘤较前次缩小，下颌小，双肾盂轻度分离，足跟声像改变。后颅窝池宽约1.09 cm。心室壁增厚，舒张期右室前壁厚约0.49 cm，上、下腔静脉扩张，见图1。

图1 胎儿超声检测异常图像

1.2 研究方法

1.2.1全基因组DNA提取 孕妇羊水标本及夫妻双方外周血标本应用标准流程提取基因组DNA(QIAamp DNA Blood Mini Kit，Qiagen，Hilden，Germany)。

1.2.2芯片捕获高通量测序 应用定制的基因片段捕获探针(Roche NimbleGen，Madison,USA)，主要针对NS相关的MAP2K1、PTPN11、KRAS、SOS1、RAF1、BRAF、NRAS基因。实验按照标准操作流程经DNA打断、末端补平、加接头后完成建库，随后进行探针捕获及LM-PCR反应，文库经Agilent 2100 Bioanalyzer 和 BMG进行片段大小、浓度检测，合格后将需要不同数据量的文库进行pooling、定量，经环化后的文库经过make DNB后利用高通量测序仪BGISEQ-500连续双向测序50个循环，并读出原始测序数据。下机数据经过测序质量评估，并应用BWA软件(Burrows Wheeler Aligner)、GATK软件进行数据分析，应用数据库(NCBI dbSNP,HapMap,1000 human genome dataset 和 database of 100 Chinese healthy adults)进行比对,采用致病性预测软件(SIFT,Polyphen2,MetaSVM,PROVEAN,M-CAP等)筛选可疑突变，根据ACMG指南对变异进行分类。

1.2.3Sanger测序验证 对于可疑突变，在其所在片段上下游设计引物。进行PCR扩增，对产物做Sanger测序，所得结果与RAF1基因标准序列NM_002880进行比对，从而验证基因芯片捕获和高通量测序的结果。并对双亲进行家系验证以明确其遗传方式。

2 结果

基因检测结果显示，患儿RAF1基因存在杂合的错义突变C.1082 G>C,p.Gly361Ala。Sanger测序验证家系成员，发现其父母此位点为正常基因型，该变异为“新发突变(De novo)”，见图2。

该变异在参考人群数据库中没有报道，多项软件预测有害，已有文献[6]报导在Noonan综合征患者中发现该突变，根据ACMG变异分类指南，该变异为致病性变异。结合文献及其临床资料，充分告知遗传学风险后孕妇选择终止妊娠。

图2 胎儿及其父母RAF1基因测序图

3 讨论

NT增厚是妊娠早期常见的超声软指标异常，其中约20%的胎儿可检出染色体异常[7]。且NT值越高，染色体异常的可能性越大，Snijders等[8]研究发现，NT≥6.5 mm时染色体异常的发生率为64.45%。本例胎儿孕12周NT值为6.7 mm，但染色体和CMA结果正常。此类NT增高的胎儿仍然是各种先天畸形和遗传综合征的高危群体，这些胎儿的父母常处于焦虑和两难的境地，需要遗传咨询和进一步的检查来明确诊断。Noonan综合征是已知与NT增厚最为相关的单基因遗传病[9]。Houweling AC等[10]在2013年尝试对NT增厚且染色体核型分析正常的75例胎儿，针对NS相关的PTPN11、KRAS、SOSl和RAF1基因进行平行测序，致病突变检出率为17.3%。

Noonan 综合征与编码RAS-MAPK通路的基因突变相关，已鉴定的有PTPN11，KRAS,SOS1,BRAF,RAF1,MAP2K1,NRAS,SHOC2,CBL。约50%的NS患者可检出PTPN11基因致病性突变[11-12]，RAS-MAPK通路在调控细胞周期、分化、生长及衰老等过程中都发挥着重要作用，编码这一通路的基因若在生殖细胞发生致病突变，相应通路的失调则会引发严重的发育障碍。NS的临床特征主要有特殊面容、身材矮小、先天性心脏病、骨骼异常、隐睾症及不同程度的发育障碍。不同基因突变所引发的临床表型不尽相同。

NS相关基因在人类基因组中的跨度达30 Kb,经典的Sanger测序技术诊断NS需多步骤处理，综合考虑相关基因突变的检出频率及其对应的特征性临床表型，PTPN11基因通常作为Sanger测序的首选基因，其次是其他RAS / MAPK途径的其它相关基因，依次如SOS1，RAF1和KRAS[13-14]，这种检测方案非常费时并且昂贵。高通量测序技术的不断发展，为Noonan综合征提供了更加高效和经济的检测方案[15]。

本例胎儿应用针对NS相关基因的靶向二代测序技术，检出了RAF1基因的新发突变C.1082 G>C,p.Gly361Ala。该突变在参考人群数据库中没有报道，多项软件功能预测有害。2007年Pandit等[5]首次报道了RAF1基因突变导致的Noonan综合征病例。RAF1基因编码的蛋白有三个保守区域：CR1,CR2和CR3。已知的RAF1致病突变大都集中在CR2区、CR3的激酶活化区域和C-末端[16]。本例突变位于保守区域CR3，但不在突变热点激酶活化区内。已知的NS相关RAF1致病突变通常直接或间接的引发MEK-ERK相关通路的过度活化，这一过程可通过增强RAF1激酶活性和/或通过增加与RAF1同源二聚体或单体相比催化活性更强的RAF1-BRAF异二聚体来实现[17-18]。Antony等人[19]发现p.Gly361Ala突变会使RAF1对RAF和MEK抑制因子产生拮抗作用。与野生型RAF1的细胞异位表达相比，RAF1Gly361Ala突变体在HEK 293/T细胞中的短暂表达会引起MEK和ERK磷酸化增加，继而导致MEK-ERK信号通路活化增强。 2017年Frederike L.等[6]报道了两例RAF1基因C.1082 G>C,p.Gly361Ala突变的患儿，患儿都具有NS典型的容貌特征，身材矮小及肺动脉狭窄，其中一例出现了肥厚型心肌病。依据ACMG变异分类指南，该变异为致病变异。

本例胎儿B超亦发现心室壁增厚，NS致病基因中，RAF1基因突变与肥厚型心肌病(hypertrophic cardiomyopathy,HCM)的发生发展最为密切相关，RAF1基因突变的NS患者约73-83%伴有HCM，且有早发HCM的可能性[20-21]。早发的HCM，有些迅速进展为充血性心力衰竭，预后极差。故早期做出准确诊断尤为重要[22]。

国外研究报道过的NS胎儿期的主要临床指征包括NT增厚、颈静脉淋巴囊(jugular lymphatic sacs,JLS)扩张、颈部水囊瘤、胎儿水肿、胸膜积液、羊水过多、先心、肾脏发育异常等[23]。本例胎儿出现了NT增高、颈部水囊瘤、心室壁增厚、双肾盂轻度分离，并伴有小下颌、足跟声像改变等，为本次基因诊断提供了依据，也为NS基因型-表型分析、NS产前筛查和基因诊断积累了临床资料。

由于Noonan综合征临床表型的多样化及其遗传异质性，NS诊断，特别是产前诊断一直极具挑战性。二代测序技术的迅速发展为这一课题提供了进一步的遗传学解读方案。本例对NS产前诊断的初步研究证实了其临床可行性，但其临床纳入指征的选择和系统化实验室诊断体系的建立仍然需要不断的数据积累和临床实践。