胃癌中神经纤毛蛋白-1(NRP1)表达及其与肿瘤微环境免疫细胞浸润关系的研究

张 鸿，李 伟，王 辉，侯 峰，刘 斐，史孟杰

(陕西省人民医院 血管外科，陕西 西安710068)

神经纤毛蛋白-1(NRP1)是神经纤毛蛋白家族中的一种跨膜非酪氨酸激酶蛋白，在血管生成、神经轴突生长和肿瘤转移中发挥重要作用[1-2]。NRP1在恶性肿瘤的表达可通过触发血管内皮生长因子(VEGF)和其他途径促进肿瘤增殖、血管生成和转移[3]。近期的研究证实NRP1信号介导的Treg在肿瘤内的蓄积可能在加剧荷瘤小鼠缺血性脑损伤中起关键作用，并且可能作为癌症和中风合并症的免疫调节靶标[4]。提示NRP1可调节免疫细胞从而影响肿瘤细胞的增值转移。在胃癌中，NRP1的高表达与肿瘤进展的发展密切相关，并与总生存率较差相关[5]。在胃癌中，肿瘤免疫微环境中的免疫细胞浸润同样发挥重要作用。一项研究表明，胃癌T细胞亚群密度高与患者生存延长有关[6]。此外，人们认为自然杀伤细胞和树突状细胞是胃癌免疫治疗的潜在靶点[7]。本研究通过生物信息学分析，拟证实NRP1基因通过调节肿瘤微环境中的免疫细胞的浸润来影响胃癌的预后。为胃癌的免疫治疗提供更多的治疗靶点。

1 生物信息分析方法

1.1 TIMER(Tumor Immune Estimation Resource)数据库

TIMER数据库(https://cistrome.shinyapps.io/timer/)是用于系统分析各种癌症类型的免疫浸润的综合数据库[8]。可以通过在所有TCGA(The Cancer Genome Atlas)数据库肿瘤中使用Diff Exp模块来区分肿瘤与邻近正常组织之间靶基因的差异表达。本研究中，我们TIMER数据库分析了NRP1在泛癌中的表达，同时通过肿瘤免疫估计分析了胃癌患者中6种类型的浸润免疫细胞(B细胞，CD4+T细胞，CD8+T细胞，中性粒细胞，巨噬细胞和树突状细胞)的丰富度，分析了NRP1表达及其相关性。并且使用Wilcoxon检验评估NRP1表达的统计学显着性，多因素分析NRP1表达、肿瘤纯度以及免疫细胞浸润对患者预后的影响，P值<0.05认为具有统计学差异。

1.2 Kaplan-Meier plotter

Kaplan-Meier plotter数据库[9](https://www.kmplot.com) 用于分析有关基因表达与恶性肿瘤患者预后的关系。本研究分析了NRP1基因 mRNA 表达水平对胃癌患者的至第一次进展时间(FP)和总生存期(OS)的影响，将患者样本按最佳分界值(高表达与低表达)分为两组，并绘制生存曲线，以P<0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 胃癌组织中 NRP1 基因 mRNA 差异表达及预后

本研究使用 TIMER 数据库比较了不同类型恶性肿瘤和配对的正常组织中 NRP1 的转录水平。分析显示，NRP1 在胃癌正常及肿瘤组织中均表达，且胃癌肿瘤组织 vs 正常组织表达具有统计学意义(P<0.001),见图 1。

另外，基于Kaplan-Meier plotter 数据库我们进一步证实，NRP1 基因高表达的胃癌患者拥有较差的至第一次复发时间(24.3月对比49.5月，P=0.0059)，同样的，NRP1高表达预示患者总生存期较差(34.7月对比70.4月，P=0.0036)，见图2。

2.2 NRP1表达与6种浸润性免疫细胞的相关性分析

通过分析NRP1表达与6种浸润性免疫细胞的相关性，发现NRP1表达与胃癌肿瘤微环境中的免疫细胞浸润相关，其中与肿瘤纯度呈负相关(r=-0.173,P=7.21e-04)，其表达与胃癌微环境中CD8+T细胞、巨噬细胞、树突状细胞、中性类细胞呈正相关，且差异具有统计学意义(P<0.05)。但是，与B细胞浸润无关(r=-0.124,P=1.74e-02)。该研究证实NRP1与胃癌免疫微环境中的免疫细胞的浸润存在相关性，见图3。

2.3 NRP1的SCNA(Somatic Copy Number Alterations)与免疫浸润的相关性

免疫监视在确定各种类型癌症的预后中的重要性已被广泛接受。为了进一步检查NRP1的基因组指标与胃癌中免疫浸润程度之间的相关性，通过GISTIC 2.0定义了SCNA。在这项基因组数据研究中，具有NRP1基因SCNA的胃癌被分为5个级别，包括深度缺失、臂级缺失、正常、臂级获得和高扩增。我们评估了所有胃癌的SCNA 6种免疫细胞的浸润情况，包括B细胞，CD4+T细胞，CD8+T细胞，巨噬细胞，中性粒细胞和树突状细胞。结果表明，NRP1的SCNA的臂级获得与6种免疫细胞的浸润均相关(P<0.05)，见图4。

图1 TIMER分析各种类型的恶性肿瘤组织和正常组织中NRP1的表达

图2 胃癌中NRP1表达水平对患者预后的影响

图3 胃癌中NRP1基因表达与肿瘤微环境中免疫细胞浸润之间的相关性

2.4 NRP1表达与免疫细胞浸润对胃癌患者预后的影响

TIMER中的多因素生存分析显示(图5)，在胃癌中，NRP1表达是影响其预后的独立的影响因素(HR:1.43,95%置信区间：1.13-1.82，P=0.003)。巨噬细胞浸润同样影响胃癌患者的预后(HR:76.53,95%置信区间：3.43-1705.40，P=0.004)。

3 讨论

NRP1参与了神经系统的发生和癌症的发病机制，在血管生成中同样发挥重要作用。研究表明，NRP1在包括胃癌在内的多种恶性肿瘤细胞中特异性高表达。NRP1可以通过诱导一系列细胞内信号级联来参与肿瘤的发展，促进肿瘤的转移[10-11]。已发表的数据表明，对NRP1表达水平的分析可以为胃癌患者的预后提供预测指标[5]。此外，NRP1也是癌症治疗的令人期待的潜在治疗靶点[12]。本文通过生物信息学分析，证实NRP1在胃癌中特异性高表达，且其为胃癌预后预测的独立影响因子，提示其可作为胃癌靶向治疗的潜在靶点。

图4 胃癌中NRP1基因SCNA类型与免疫细胞哦浸润之间的关系

图5 免疫微环境中免疫细胞浸润对胃癌患者预后的影响

关于NRP1表达与胃癌患者临床患者预后之间的关系目前尚无定论。多项研究检测了NRP1蛋白在胃癌中的表达，分析了NRP1蛋白异常表达与胃癌临床病理特征的关系。杨等人的研究[13]证明NRP1表达与胃癌的淋巴结转移呈正相关，有些研究却得出相反的结论[14]。一项研究证实，高表达NRP1和PDGFRB的胃癌患者比其他患者的死亡风险增加近两倍[5]。一项荟萃分析来评价NRP1蛋白的表达与胃癌的临床病理特征之间的相关性，此研究共纳入12项研究，包括1225名胃癌患者。结果表明，肿瘤大于5 cm的胃癌NRP1蛋白表达阳性率高于肿瘤小于5 cm的胃癌，Ⅲ-Ⅳ期高于Ⅰ-Ⅱ期，低分化高于良好/中度分化，淋巴结转移高于无淋巴结转移[15]。本研究结论与上述研究相似，即NRP1高表达是胃癌预后不佳的预测因子。

本研究证实，NRP1表达与胃癌肿瘤微环境中的免疫细胞浸润相关，其中与CD8+T细胞、巨噬细胞、树突状细胞、中性粒细胞浸润呈正相关。与B细胞浸润无关。提示NRP1与免疫细胞的浸润存在相关性，可能参与肿瘤的发生发展。肿瘤微环境中免疫细胞浸润在肿瘤浸润性免疫细胞可通过直接或间接参与免疫应答和血管生成影响肿瘤患者的预后。例如，树突状细胞可以捕获和呈现肿瘤细胞释放的抗原；CD8+T细胞可以溶解和吞噬肿瘤细胞[16-18]。上述研究提示实体肿瘤与肿瘤免疫微环境中的免疫细胞浸润有关，可显著影响治疗疗效和整体生存率。

巨噬细胞浸润与恶性肿瘤之间的相关性是目前研究的热点问题。众所周知，巨噬细胞是一种多用途的细胞，在不同的趋化因子刺激下，可以极化为促炎巨噬细胞M1和免疫抑制巨噬细胞M2[19]。 其中M1和M2均参与肿瘤进展过程，但M1通过激活毒性中间体和活性氧中间体的产生，主要起保护因素，而M2则是其促进肿瘤进展和转移的危险因素[20-21]。巨噬细胞M0具有与M1相似但稍弱的功能。一项旨在探索免疫微环境免疫浸润与胃癌预后的相关性的研究并未得出理想的结果，巨噬细胞与胃癌患者病理分期有关，但是与胃癌患者的总生存期无关[22]。在本研究中，巨噬细胞浸润与胃癌的预后呈负相关，结合前面的结果，NRP1表达与巨噬细胞呈正相关，提示，NRP1可能与巨噬细胞相互作用，导致胃癌进展。具体的结论尚需后续的分子实验证实。

综上所述，本研究利用生物信息学分析证实，NRP1可作为胃癌患者的一个重要的临床生物标志物和免疫治疗靶点提供了全面的证据。NRP1转录水平与胃癌的生存结局和肿瘤浸润免疫细胞显著相关。NRP1可能在肿瘤免疫细胞的浸润中发挥重要作用，并可作为胃癌的预后生物标志物加以应用。