小鼠臂丛离断对脊髓运动神经元树突结构与形态退变的影响

李咪，许嘉玮，邹颖，郭家松

南方医科大学基础医学院组织胚胎学教研室，广州 510515

树突是神经元的重要结构，躯体运动神经信号传导需要大脑上运动神经元发出的指令传达至周围神经以支配靶器官，脊髓运动神经元树突在该过程中发挥关键作用。周围神经损伤先导致损伤处轴突断裂及远端轴突退变，而后会导致对应脊髓节段内的运动神经元树突退变与回缩[1,2]。树突退变意味着大脑皮层上运动神经元发出的轴突终末失去突触后成分，此现象称为“突触剥离”[3]，是运动功能障碍的重要原因。长久以来，对周围神经损伤的研究几乎集中于损伤区的轴突[4,5]。然而，即便采取措施促进轴突再生，甚至实现了靶区肌组织神经的良好再支配，患者的运动功能也很难恢复到正常水平，这说明除轴突以外运动神经元树突的退化也不可忽视。Ruijs 等[6]基于23项临床报道统计分析发现，仅有51.6%的尺神经或正中神经损伤患者运动功能修复满意。目前对于周围神经损伤后运动神经元树突变化的研究甚少，现有的结果仅验证了轴突损伤导致运动神经元超微结构改变[7]和树突退化[2,8,9]，而树突发生退变的过程和形态变化规律，以及不同距离损伤对树突退化的影响等未见报道。本研究采用小鼠臂丛离断模型，通过MAP2 免疫荧光和体视学分析，以及Golgi-Cox 染色和Sholl 分析等方法，探究臂丛离断后运动神经元树突结构和形态退变的过程与规律，期为周围神经修复提供形态学依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物与主要材料

选用C57BL/6 小鼠，不分性别，8 周龄，体重20～30 g，南方医科大学动物中心提供。主要试剂包括兔抗MAP2 单克隆抗体（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen）；Alexa Fluor 568 山羊抗兔荧光标记抗体（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen）；Golgi-Cox 染色Kit（Hitobiotec）。

1.2 实验方法

1.2.1 造模 小鼠腹腔注射三溴乙醇（12.5 g/mL，0.2 mL/10 g 体重）进行麻醉，暴露和钝性分离右侧臂丛，在距离椎间孔3 mm 或10 mm 处剪断所有的臂丛分支。左侧臂丛只进行暴露和钝性分离（标注为contralateral 组）。

1.2.2 组织收集 术后7、14、28、56 d，每个时间点取10 只小鼠，其中5 只用于免疫荧光染色，小鼠以三溴乙醇麻醉，经心灌注生理盐水和4%多聚甲醛（PFA），取脊髓C6～7节段浸泡于4%多聚甲醛内；另5 只用于Golgi-Cox 染色，小鼠麻醉后快速断头，取出脊髓C6～7节段用ddH2O 洗净血液后立刻放入Golgi-Cox 染色Kit 中的溶液1，2 混合液中（比例为1 液：2 液＝1：1，该混合液需提前24 h 混匀备用），脊髓避光浸泡14 d后更换为溶液3 继续浸泡5 d 备用。

1.2.3 免疫荧光染色 经4% PFA 固定的脊髓以30%蔗糖脱水过夜，利用冰冻切片机（Leica）制备脊髓横切片（厚度为10 μm）。切片用0.01 mol/L 磷酸盐缓冲液（PBS）洗3 次，每次5 min。0.5%TritonX-100 室温透膜30 min，5%鱼胶（Sigma）室温封闭1 h；加入兔抗MAP2 单克隆抗体（1：400）4 ℃孵育过夜；次日复温20 min 后PBS 漂洗3 次；Alexa 568 荧光标记二抗（1：800）室温避光孵育2 h。

1.2.4 Golgi-Cox 染色 浸泡好的脊髓放入用液氮冷却的异戊烷中急冻，用冰冻切片机制备横切片（厚度为90 μm），切片贴于滴有溶液3 的载玻片（用4%明胶包被），避光晾干过夜。切片用流动的ddH2O 冲洗，用溶液4、5 的混合液（比例为1：1）浸染10 min，乙醇梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

1.2.5 免疫荧光图像处理及定量分析 免疫荧光图片用正置显微镜（Leica）拍摄，在脊髓前外侧角截取200 μm × 200 μm 的正方形区域，利用Image J 软件在图片上做横竖各3 条间隔为50 μm 的划线。计数MAP2 阳性树突与划线的交点，以及与划线交点数≥2的树突个数（图1A）。

1.2.6 Golgi-Cox 染色图形处理及Sholl 分析 在Golgi-Cox 染色的脊髓前外侧角选择胞体和树突显示完整的运动神经元，利用Image J 软件将该神经元及其树突从图像中分割出来。将神经元胞体及树突用软件自动识别生成围绕神经元周围的等距同心圆环（12 μm）标记线。计数树突与同心圆交叉的个数[10]，在此基础上统计每个神经元的最长树突、总树突长度、树突最大跨度、树突各级别分支的数量[11～14]（图1B）。

1.3 统计学处理

使用SPSS 20.0 软件（IBM，USA）进行统计学分析，数据用均值±标准差（）表示。组间差异使用单因素方差分析（one-way ANOVA，Bonferroni post hoc-comparison）进行比较，P＜0.05 认为数据具有统计学差异。使用GraphPad Prism 8.0（GraphPad Software，USA）软件作图。

2 结果

2.1 臂丛离断后脊髓前角树突密度和完整度随时间推移下降

为研究脊髓运动神经元树突在周围神经损伤发生后随时间发展的变化规律，将小鼠单侧臂丛距离椎间孔3 mm 处离断，术后7、14、28、56 d 取材染色。MAP2 免疫荧光结果显示，离断侧脊髓前角MAP2 阳性树突的整体密度下降，且树突结构的退变呈时间依赖，树突总数量减少的同时，其形态由长条状逐渐退化为片段状（图2A）。定量统计显示树突与测量切线交点总数随时间进程逐渐减少，表明树突密度减少（图2B），与切线交点数大于2 的树突片段数也逐渐减少，表明树突完整性下降（图2C）。各时间点对侧组均未发生显著变化，图2B、C 中contralateral 组所示数据为各时间点的平均值。

2.2 臂丛离断后脊髓运动神经元树突长度及复杂度随时间推移降低

为显示脊髓运动神经元树突结构变化的细节，通过Golgi-Cox 染色以及Sholl 分析对单个运动神经元的树突进行分析，其中长度指标包括最长树突、树突总长、树突最大跨度，复杂度指标包括树突第1、2、3级分支的数量。结果显示未损伤侧各项指标并未随时间变化（图3，图4A～E），而损伤侧神经元的树突各项指标随时间逐渐下降，直至损伤后56 d 几乎完全消失（图3，图4F～I，K，L）。损伤早期1 级树突分支的数量几乎没有受到影响，但术后28、56 d 出现显著减少（图4J）。

2.3 不同距离臂丛神经离断对脊髓前角内树突密度和完整度的影响

如前所述，在距离椎孔3 mm 进行臂丛神经离断后28 d 脊髓前角运动神经元树突各项指标均发生显著的退变，而56 d 时已几乎观察不到完整的树突结构，因此选择28 d 进行远距离（10 mm）与近距离（3 mm）臂丛神经离断后树突退化的比较。MAP2 荧光染色结果显示，远距离损伤后脊髓运动神经元树突总密度下降情况较轻，与对照的近距离损伤组差异显著（图4A，B）。但树突完整度的下降并未受到距离因素的显著影响（图4C）。

2.4 不同距离臂丛离断对脊髓运动神经元树突长度及复杂度的影响

为进一步探索周围神经损伤距离影响运动神经元树突树结构退化的差异，远距离（10 mm）与近距离（3 mm）臂丛离断28 d 的脊髓同步做Golgi-Cox 染色和Sholl 分析（图6）。结果显示，远距离损伤侧的长度指标下降幅度远低于近距离的损伤侧（图7A～G）。然而，关于复杂度的统计结果显示，1 级、2 级、3 级树突分支数在两组的损伤侧之间均未有统计学差异（图7H～J）。

3 讨论

周围神经遍布全身，各种创伤可造成不同程度的周围神经损伤。当损伤部位靠近中枢近端的神经主干时，神经再生十分困难，且涉及的因素比较复杂，神经元树突退变就是其中之一[15]。王树森等人[2]发现大鼠坐骨神经离断会造成运动神经元胞体总体积下降，进而说明损伤后脊髓前角运动神经元的树突会产生持续性收缩。刘蔡钺[16]发现，小鼠坐骨神经离断会导致脊髓运动神经元周围突触数下降。Wiberg 等人[17]在基于大鼠L4～5腹根撕脱伤和远端周围神经切断的研究中，发现脊髓前角神经末梢的突触素和MAP2 含量显著减少，表明周围神经切断显著降低突触频率和减少树突分支。然而，以上的研究主要以坐骨神经或臂丛撕脱的模型为基础，关注于运动神经元胞体本身或突触的变化，未具体阐述周围神经损伤后树突的结构和形态的退变过程和变化规律。

本研究采用小鼠臂丛离断模型，该模型具有以下优点：①臂丛相对坐骨神经来说，离脊髓距离更近，臂丛离断后，脊髓运动神经元树突退变将更加明显，有助于探明损伤后树突形态变化的规律；②臂丛离断模型相对夹伤模型而言，排除了轴突再生以及树突重塑对结果的影响。为更全面评估树突形态的变化，选择树突总长度、树突最大跨度和最长树突的长度，以及各级分支的数量来评价树突的形态变化。其中树突总长度和最长树突可指示树突间的相互作用、评价树突传入功能以及突触数量[18]，树突最大跨度则标志着树突信号接收的最大范围[19]。树突各级分支数量是评价树突复杂程度的重要指标，反映了树突接受神经信号的效率[11]，其中，初级（1 级）分支数反映树突的发育是否健全[20]，高级（2 级以上）分支的数量代表树突的生长状态，其数量增多代表树突处于旺盛生长[21]。

基于臂丛离断模型及上述树突评价指标，本研究首次阐明臂丛损伤后脊髓前角运动神经元的树突结构和形态的退变规律。本实验发现，臂丛损伤7 d 后树突总密度和完整度显著下降，单个运动神经元树突的长度以及复杂度开始出现显著的退化，且退化程度随时间推移而加剧。这意味着树突接收信号范围变小，与周围树突交流和互相作用的能力下降，且周围神经损伤不但直接引起了脊髓运动神经元树突固有结构退变还可能影响其已经稳定的生长状态。相比于损伤区域在早期就开始发生华勒变性的轴突[22]，树突退变的进程更加缓慢持久。轴突损伤28 d 后往往已能够再生甚至实现靶器官再支配，而本研究发现臂丛离断28 d 后最长树突、树突总长、树突最大跨度，复杂度指标包括树突第1、2、3 级分支的数量均出现明显的退变。这也正好解释了即使轴突实现再生、靶器官再支配，运动功能恢复效果仍不如意的情况。紧接着构建了不同距离（3 mm 和10 mm）的臂丛离断伤模型，在树突退变较显著的离断28 d 比较不同距离离断后树突结构的变化。结果提示，两种距离离断引起树突复杂度降低的情况没有显著差异，但远距离离断组树突长度下降幅度远低于近距离离断组。由此可见，距离因素虽对树突复杂度退变的影响不大，但对树突长度退变的影响十分明显。这也解释了临床慢性周围神经损伤患者修复手术后功能修复效果差以及越靠近身体近侧端的周围神经损伤越难修复的问题。

综上，本研究揭示了小鼠臂丛离断后树突退变结构与形态随时间的变化及不同距离的臂丛离断树突退变的差异。提示关于周围神经修复的研究不仅需要关注损伤区的轴突及髓鞘的再生，还需要关注受损神经元树突的退化及再生的病理变化及相关作用机制。缓解树突的退变及促进树突有效重塑将是提高周围神经损伤修复的重要策略。