ABO等位基因新变异引起正反定型不符2例

苏蔓 赵倩 郭霞 王远花 乔芳 王振雷

ABO血型系统是人类认识最早的血型系统，其在临床输血、法医学鉴定、器官移植等领域均有重要的临床意义[1]。人类ABO血型系统的抗原多态性较高，除常见的A、B、AB、O 4种血型之外，进一步细分的ABO血型，称为ABO亚型。ABO亚型在基因上多由一个或几个碱基突变引起，本实验室血型血清学检测ABO正反定型不符标本2例经测序均发现ABO新等位基因，现报道如下。

材料与方法

1 标本 先证者1，男，57岁，因颈椎病入院后血型检测ABO正反定型不符送本实验室确认；先证者2，女，26岁，孕39周因剖宫产手术术前备血血型鉴定ABO正反定型不符送本实验室确认。

2 血清学检查 血型鉴定按文献[2]及说明书进行操作，试剂包括单克隆抗-A（上海血液生物医药有限公司，批号：20150407）、抗-B标准血清（上海血液生物医药有限公司，批号：20150407），抗-H试剂（上海血液生物医药有限公司，批号：20150129），抗-A1试剂（上海血液生物医药有限公司，批号：20151027），反定型Ac、Bc、Oc（上海血液生物医药有限公司，批号：20165311）。

3 基因组DNA提取 采用血液基因组DNA抽提试剂盒（天根生化科技有限公司，批号：O3327）严格按产品说明书提取DNA。

4 基因测序 对样本ABO基因扩增产物直接进行6、7外显子测序，因测序结果无法区分突变所发生的单链，为进一步区分将PCR扩增产物连接载体进行克隆测序，测序服务由天津秀鹏生物技术开发有限公司提供。使用Chromas Version 2.6.5软件阅读测序图谱，并与ABO*A1.01序列比较确定突变位点。

结 果

1 ABO正反定型结果 2个标本的血型血清学检测结果如表1所示，均表现为正反定型不符。

表1 ABO正反定型鉴定结果

2 样本测序结果 单链测序后结果与ISBT（International Society of Blood Transfusion，国际输血协会）网站“Names for ABO（ISBT 001）Blood Group Alleles”比对。样本1单链1测序结果与ABO*A1.01序列比对发现第7外显子c.467C＞T和c.978C＞A共2个突变，其中c.467C＞T为ABO*A1.02和ABO*A1.01的差异碱基，c.978C＞A突变未见有报道；样本1单链2测序结果与ABO*A1.01序列比对发现第7外显子c.526C＞G、c.657C＞T、c.703G＞A、c.796C＞A、c.803G＞C和c.930G＞A共6个突变，与标准序列比对后判定为等位基因ABO*B.01；样本2单链1测序结果与ABO*A1.01序列比对发现第7外显子c.523G＞A、c.526C＞G、c.657C＞T、c.703G＞A、c.796C＞A、c.803G＞C、c.889G＞A和c.930G＞A共8个突变，即在ABO*B.01的基础上发生了c.523G＞A+c.889G＞A双突变，与ABO*B.01序列相比，单独的c.523G＞A突变已有报道且被ISBT命名为ABO*BW.14，单独c.889G＞A突变已被命名为ABO*BW.34，同时具有此双突变的等位基因尚未见有报道；样本2单链2测序结果与ABO*A1.01序列比对发现6、7外显子c.261delG、c.297A＞G、c.646T＞A、c.681G＞A、c.771C＞T和c.829G＞A共6个突变，与标准序列比对后判定为等位基因ABO*O.01.02。突变位点及结果判读如表2所示。

表2 2个样本单链测序结果

样本1的A基因链第7外显子c.978C＞A突变，样本2的B基因链第7外显子c.523G＞A、c.889G＞A双突变，测序峰图如图1、图2所示。

图1 样本1的A基因在ABO*A1.02基础上发现新突变，c.978C＞A

图2 样本2的B基因在ABO*B.01的基础上发现双突变，c.523G＞A，c.889G＞A

讨 论

ABO亚型在临床上常表现为血型血清学试验正反定型不符。在亚型血清学鉴定中，为了确定具体的亚型类别，除常规使用抗-A、抗-B以及A、B、O型红细胞外，还必须引入其它一些试剂如：抗-A1，抗-AB，抗-H，A2细胞等，有时为区分亚型的具体类别还需进行吸收放散试验证实红细胞上的抗原以及利用唾液进行血型物质分析等。本研究血清学试验部分因未进一步试验区分具体的亚型，故该部分结果仅笼统表述为A亚型或B亚型。同时，样本1血清学反应格局与B（A）/B相近，需用A2细胞进行进一步区分，如反应为弱凝集则为B（A）/B，如无反应则为A亚B，本研究由于条件所限未得到A2细胞，故未能进行进一步血清学区分，而是直接进行分子生物学测序分析。

ABO基因位于染色体9q34.1-34.2，其基因不是直接翻译产生ABO抗原，而是编码特异性糖基转移酶，催化不同单糖转移到底物受体H抗原上[3]。ABO基因共有7个外显子组成，其中6、7外显子占全部编码区长度的77%，编码了91%的糖基转移酶催化活性区域，故ABO基因的多态性主要取决于6、7外显子的变化。ABO等位基因变异类型以碱基替换为主，此类替换极少引起酶特异性的改变，而是通常表现为酶活性的下降，造成血型抗原表达减弱从而产生亚型[4，5]。

本文报道的2个案例是以血清学改变为初步印象，测序后均发现未报道的等位基因。样本1的A基因在ABO*A1.02的基础上发生了c.978C＞A的突变，导致编码氨基酸p.Asp326Glu变异，而Asp和Glu均为极性带负电荷氨基酸（酸性氨基酸），但等电点（pI）略有差异，是否由酸性更强的Asp（pI=2.77）突变为酸性较弱的Glu（pI=3.22）影响了酶的构象从而造成酶活性的降低，导致对应抗原表达减弱，尚待进一步研究证实。样本2测序后发现其B基因在ABO*B.01基础上发生了c.523G＞A和c.889G＞A联合突变。在ABO*B.01基础上单独c.523G＞A和c.889G＞A的突变对应的基因均已被命名，分别为ABO*BW.14和ABO*BW.34，而本研究样本2中发现该2个位点的联合突变尚未见有报道，且血清学试验结果表现为B抗原减弱，推测为Bw亚型新等位基因。Bw亚型抗原减弱的原因可能是一种或多种机制并存[6]。本研究样本2中B基因的双突变中单独任意一个突变均可造成抗原表达减弱（对应等位基因已被命名），但具体机制仍不清楚。有研究表明，176位p.Arg176Gly为N-乙酰半乳糖胺转移酶（GTA）和D-半乳糖基转移酶（GTB）差异蛋白之一，且位于活性位点（21个氨基酸的无序环）之前，176位由Arg突变为Gly后，GTA的催化常数增加且特异性增强[4]。样本2中B基因的双突变中的c.523G＞A突变导致紧邻176位的175位发生p.Val175Met变化，该变化是影响了176位的Gly参与的酶构象，还是175位的氨基酸变化直接影响了酶的活性导致抗原减弱，还需进一步研究确认。同时，样本2中发现的双突变现象在ABO亚型基因中非常常见，如在ABO*01.01基础上c.721C＞T突变为ABO*AW.04，c.523G＞A联合c.721C＞T突变被命名为等位基因ABO*AW.11；c.467C＞T是ABO*01.02和ABO*01.01的差异碱基，c.467C＞T联合c.721C＞T突变被命名为等位基因ABO*AW.43。此类双突变可能是含有不同突变位点高度同源的2个基因发生交换重组产生的。在对抗原表达的影响上，双突变导致的氨基酸的同时变化是否对抗原减弱有叠加效应，也需进一步研究确认。

值得关注的是很多报道中的碱基突变为同义突变，并未造成编码氨基酸的改变，但却引起了血清表现型的改变，可能是虽为同义密码子，但其使用频率却是不相等的，此现象被称为密码子的偏好性。研究发现，密码子的使用偏好性影响RNA加工、蛋白质翻译、折叠等多个过程，对基因的表达和产物功能有重要意义，可能上述原因为某些报道中同义突变导致血清学改变的因素之一[7，8]。同时，也有相当多的ABO亚型的整个外显子核苷酸序列均正常，抗原的表达异常可能与ABO基因内含子碱基突变或外显子的剪切部位以及基因启动子、增强子碱基突变有关[9]。

ABO亚型的命名是以血清学为基础的，ABO亚型应有明确的血清学特点，而那些虽然有碱基改变，但并不影响血清学特点的ABO血型不能称为亚型[9]。本研究在发现血清学变化的基础上，对样本ABO基因6、7外显子扩增后测序，发现了基因突变，推测为该突变引起基因表达产物活性的改变从而导致血清学结果的变化，可以判定为造成ABO亚型表现的新等位基因，下一步拟向ISBT进行申报确认。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突