AMPK信号通路在小鼠急性肾损伤发生中的作用

毛艳 卢丽 肖辉 刘潇

急性肾损伤是一种常见的临床危重病症，多伴随有肾纤维化[1]。当肾损伤发生后，氧供应突然减少，葡萄糖酵解代谢途径供能不能满足机体需要，加上代谢底物的减少进一步加重能量短缺，导致细胞水肿、细胞内钙超载，从而引发一系列细胞损伤[2，3]。阿德福韦酯可导致肾损伤，机制与其在肾小管蓄积浓度过高有关，可用来构建小鼠急性肾损伤模型[4，5]。磷酸腺苷激活蛋白酶（adenosine phosphate activating protease，AMPK）被称为能量代谢的“感受器”，是一种在细胞内调节能量代谢的重要蛋白激酶[6，7]。AMPK可通过直接磷酸化细胞内的一系列酶，或通过协同激活因子、磷酸化转录因子和协同抑制因子对代谢进行转录调控[8，9]。AMPK也可参与骨骼肌、肝脏、胰腺、下丘脑、脂肪等器官和组织的基因合成与蛋白代谢，从而保证机体的生理平衡[10，11]。本文通过建立阿德福韦酯小鼠急性肾损伤模型，探讨AMPK信号通路在小鼠急性肾损伤发生中的作用。现总结报道如下。

资料与方法

1 研究材料 SPF级BALB/c雄性小鼠（48只）购自本地区实验动物中心，许可证SCXK（2018-0007）。室内温度20℃～28℃，湿度40%～60%，每笼6只，饲养环境通风良好，光线充足，自由摄食摄水。实验前令动物在饲养环境中适应7天。阿德福韦酯片购自河北医科大学制药厂（国药准字H20100172，批号20194422）。GAPDH内参抗体与AMPK、Keap-1多克隆抗体购自Sigma公司。

2 实验方法与步骤

2.1 小鼠分组与处理：将所有小鼠随机分为两组，对照组与实验组各24只。对照组：用等渗盐水进行灌胃处理。实验组：采用阿德福韦酯40 mg/kg灌胃处理，1次/周，持续2次。

2.2 检测指标：在处理后2周、4周、6周各处死8只小鼠。①将血液标本加入离心管，静置30 min，2 500 r/min离心15 min，取上层血清，采用全自动生化分析仪测定尿素氮（BUN）与肌酐（SCr）水平。②同时取小鼠的肾脏组织，–70℃冰箱保存，其中部分组织研磨成匀浆后，提取蛋白，根据BCA蛋白定量试剂盒说明书进行蛋白定量，再将制备好的蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，采用Western blotting检测肾组织中AMPK、Keap-1的表达，以GAPDH作为内参。③另外取部分肾脏组织用4%多聚甲醛固定，然后依次进行脱水、透明、浸蜡、包埋等操作，经苏木精-伊红染色后，在光镜下观察肾组织的病理学变化，肾脏的病理损害评分标准[12]：1分，肾间质炎性细胞浸润；1分，肾间质充血；1分，细胞核固缩；1分，肾小管腔内有脱落、坏死的细胞；1分，上皮细胞颗粒变性；1分，肾小管显著扩张、细胞扁平；0分，正常肾小管。分数越高，肾脏病理损害越严重。

3 统计学处理 选择SPSS 22.00统计学软件与Prime Graphpad软件对计量数据进行统计学分析，计量数据以均数±标准差表示，对比方法为独立样本t检验，检验水准为a=0.05。P＜0.05表示差异有统计学意义。

结果

1 肾功能对比 实验组处理后2周、4周、6周的血清BUN与SCr水平都显著高于对照组（P＜0.05）。见表1。

表1 两组处理后不同时间点的肾功能对比（）

表1 两组处理后不同时间点的肾功能对比（）

2 肾脏组织病理学评分对比 实验组处理后2周、4周、6周的肾脏组织病理学评分都显著高于对照组（P＜0.05）。见表2与图1。

表2 两组处理后不同时间点的肾脏组织病理学评分对比（分，）

表2 两组处理后不同时间点的肾脏组织病理学评分对比（分，）

图1 两组肾脏组织病理特征（HE染色，×400，对照组：正常状态；2周：肾间质充血；4周：细胞核固缩；6周：肾小管腔内有细胞脱落）

3 AMPK与Keap-1表达水平对比 实验组处理后2周、4周、6周的肾脏组织AMPK与Keap-1蛋白相对表达水平都显著高于对照组（P＜0.05）。见表3与图2。

表3 两组处理后不同时间点的肾脏组织AMPK与Keap-1表达水平对比（%，）

表3 两组处理后不同时间点的肾脏组织AMPK与Keap-1表达水平对比（%，）

图2 AMPK与Keap-1表达水平

讨 论

急性肾损伤在临床上比较常见，也是临床危重患者最主要的死亡原因之一[13]。肾脏是除了肝脏以外多种药物代谢的重要场所，当药物经血液进入肾脏时，往往因滤过而被浓缩，容易导致肾小管受损[14，15]。其中阿德福韦酯对肾脏的损伤表现为肾小管的结构和功能改变，是构建急性肾损伤小鼠模型的常见方法[16]。本研究显示实验组处理后2周、4周、6周的血清BUN与SCr水平都显著高于对照组（P＜0.05）。临床研究也显示在使用阿德福韦酯的过程中，表现为肾小球滤过率下降或SCr上升，提示患者存在肾功能损伤[17]。但是当前影响血清BUN与SCr的因素非常多，特别是严重急性肾损伤患者往往存在程度不等的营养不良，使得肝脏将肌酸转化为肌酐的能力减弱，导致血清BUN与SCr很难真实反映肾功能的状态[18，19]。

本研究显示实验组处理后2周、4周、6周的肾脏组织病理学评分都显著高于对照组（P＜0.05）。肾组织病理形态学评分提示急性肾损伤的程度，其主要表现为肾脏形态结构显著改变，可见肾小管扩张，肾小管上皮细胞肿胀和空泡变性，管腔内有管型和坏死脱落细胞，部分肾小管结构损伤，少量管腔内有蛋白性液体积聚等。

AMPK内含一个催化性α亚单位和调节性β、γ亚单位，AMP结合到γ亚单位后，使苏氨酸172位点更易被磷酸化，变构激活复合体，造成胞内钙离子水平变化[20，21]。AMPK可对低水平ATP做出反应，对补充细胞 ATP供应的信号转导通路进行正向调控[22]。AMPK-Keap-1信号途径在维持机体细胞内正常的氧化还原平衡方面发挥重要作用，且该信号通路广泛存在于多细胞生物体内，在进化上保持高度保守[23]。肾损伤可激活AMPK，通过减少能量产生保护肾功能，进而削弱细胞线粒体功能，形成恶性循环。当肾损伤减轻后，Keap-1因子会进入细胞核重新与AMPK结合，并转位到细胞质，使AMPK的表达处于低水平[24，25]。本研究显示实验组处理后2周、4周、6周的肾脏AMPK与Keap-1蛋白相对表达水平都显著高于对照组（P＜0.05），表明小鼠急性肾损伤可伴随有AMPK信号通路的激活。本研究也有一定的不足之处，对AMPK信号通路的机制阐述不够深入，且样本数量较少，将在后续研究中进一步分析。

综上，小鼠急性肾损伤可激活AMPK信号通路，诱导AMPK与Keap-1表达量上升，导致肾脏组织损伤与肾功能下降。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突