储存红细胞中表达降低的circRNA以及其靶基因预测的研究*

张怡宇 黄国清 王强 张勇刚 苑召虎 陈小洁 黄建云 李楠 魏亚明

在低温储存条件下，储存红细胞会发生一系列的变化，也称为储存损伤。氧化损伤和代谢障碍是储存损伤的原因，而ATP减少、2,3-DPG变化、离子泵功能、RBC膜和细胞骨架的重组和破坏、血红蛋白和氧化蛋白的结合、带3蛋白的降解以及筏蛋白的变化是储存损伤的具体表现[1]。在储存过程中积累的部分生物反应调节剂（BRM）会充当输血受血者的促炎剂，例如细胞因子、趋化因子、生物活性脂质和代谢产物[2]。如果将这些发生变化的血制品输入到患者，有可能引起输血不良反应。在低温保存条件下，供体红细胞的表现存在广泛的遗传变异性，所以在组学基础上制定新途径来减少储存损伤也十分不易[3]。

在全血中，环状RNA（circular RNA，circRNA）是转录组的天然成分[4]。circRNA呈闭合环形结构，在无核细胞中大量存在。它不易被核糖核酸酶R水解，而且比线性RNA更稳定，所以更适宜用作生物标记物[5，6]。除此外，circRNA是高效的miRNA海绵，通过不同的结合位点能吸附多个miRNA，通过解除miRNA对mRNA的抑制作用，来促进mRNA表达及蛋白翻译，参与调节多种信号通路[7，8]。circRNA还可以起到存储，分类或定位RBP（RNA结合蛋白）的作用，如Foxo3环状RNA与特定蛋白质之间的相互作用显示出可延缓细胞周期进程[4]。

在多数疾病中，circRNA上调和下调与具体的疾病机制密切相关。在无核细胞中，整个转录组呈降解趋势。已有研究证明在储存红细胞中非编码RNA之一的miRNA下调模式更为明显[9]，而本研究中下调的circRNA数量远大于上调的circRNA数量，研究下调的circRNA更具代表意义。下调的circRNA其作为储存损伤标志物的候选者更为合理。基于这个背景，本研究对储存20 d的红细胞和新鲜红细胞采用高通量测序，观察下降明显的circRNA的表达变化及circRNA所对应的miRNA的分子功能，用生物信息学方法分析下降明显的circRNA、其靶miRNA及miRNA关联的mRNA并进行PCR验证，预测其功能以及作为储存损伤标志物的可能性。

材料和方法

1 一般资料 血液标本为5名25～30岁O型健康合格献血者的标本200 mL（人）份，与CPDA-1保存液混合，过滤去除白细胞后制成悬浮红细胞，分别收集新鲜组（0 d）、20 d收集标本进行试验。收集方法如下：以（1 000 g，20 min，4℃）为条件进行轻离心，在生物安全柜内将血浆层（去除血小板和血浆）吸走，留取红细胞层，用PBS洗涤三次。其中3名健康者标本用来circRNA测序，所有5名健康者标本用来circRNA的RT-qPCR验证。所有试验均分为0和20 d 2组。研究获本院医学伦理委员会批准（K-2018-027-01）。

2 试剂与仪器 红细胞保存液CPDA-1购自广州费森尤斯卡比；0.9%生理盐水购自佛山双鹤药业；PrimeScript RT Master reagent Kit with gDNA Eraser（perfect Real Time）、SYBR Premix Ex Taq Master MixⅡ、无酶水均购自日本TaKaRa公司；TRIzol-LS购自美国life公司；RNaseR购自美国Epicentre公司；一次性白细胞过滤输血器购自南京双威公司；自动红细胞计数仪购自北京赛科希德公司；电热恒温培养箱购自上海精宏公司；低温高速离心机购自美国Eppendorf公司；引物序列由上海捷瑞合成；使用qTOWER2.2购自德国analytikjena的PCR仪做qRTPCR检测。

3 circRNA高通量测序检测 3名健康者标本的新鲜红细胞和4℃储存20 d红细胞分别提取总RNA储存于-80℃，进行circRNA高通量测序。对0 d组、20 d组的6份标本（3份/组）做高通量测序。

4 circRNA的生物信息学方法与流程 对下调明显的十个circRNA的类型、来源、新旧进行分析，最终完成其功能注释。用circBase（http://circbase.org/）与mirTarBase（http://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/php/index.php）完成数据库注释与靶向预测。然后对cirRNA作用miRNA进行靶标预测，所用软件是mireap（http://mireap.sourceforge.net/），miranda（https://sourceforge.net/projects/mireap/），targetscan（http://www.targetscan.org/vert_72/）。并将miRNA可能作用的mRNA也进行了关联分析，所用软件是mirTarBase（mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/php/index.php）。

5 circRNA、miRNA、mRNA表达量的测定 采用qRT-PCR方法测定miRNA的相对表达量，具体方法参考文献[10]。circRNA的引物如表1所示，miRNA及mRNA引物设计用软件prime3（http://frodo.wi.mit.edu/primer3/）完成。

表1 qRT-PCR用到的引物

6 统计学处理 应用SPSS 16.0软件和Graphpad Prism5软件行配对t检验，数据以均数±标准差（）表示，P＜0.05表示差异有统计学意义。

结 果

1 测序结果分析 红细胞在储存20 d对比0 d中，下调明显的10个circRNA有：hsa_circ_0005413、novel_circ_0002503、hsa_circ_0008937、hsa_circ_0040340、hsa_circ_0003126、hsa_circ_0007995、hsa_circ_0023937、novel_circ_0000402、hsa_circ_0049462、hsa_circ_0028281（图1）。下调明显的前10个circRNA有3条来自11号染色体，且这10个circRNA均来自外显子（表2）。Novel命名的circRNA表示在红细胞中发现的新circRNA，即目前未被circBase数据库收录的circRNA。

表2 circular RNA类型统计表

图1 circRNA表达情况热图（n=3）

2 生物信息学预测结果 利用生物信息学软件预测发现下降明显的十个circRNA中，hsa_circ_0005413能海绵吸附hsa-miR-6748-3p，hsa-miR-6871-5p，hsamiR-7160-5p，其中hsa-miR-6871-5p能靶向作用于BACH1（basic leucine zipper transcription factor 1，

碱性亮氨酸拉链转录因子1）、SOD2（superoxide dismutase 2，超氧化物歧化酶2）等mRNA；hsamiR-7160-5p能靶向作用于EIF2AK2（eukaryotic translation initiation factor 2-alpha kinase 2，真核翻译起始因子2-α激酶2）、CASP8（caspase 8，半胱天冬酶8）等mRNA。hsa_circ_0008937能海绵吸附hsa-miR-6778-3p，hsa-miR-6778-3p能靶向作用于SH3BP5（SH3-domain binding protein 5，SH3-结构域结合蛋白5）、AKAP2（A kinase（PRKA）anchor protein 2，激酶（PRKA）锚蛋白2）、PPP1R12C（protein phosphatase 1，蛋白磷酸酶1）等mRNA。hsa_circ_0040340能海绵吸附hsa-miR-122-5p、hsamiR-3173-5p、hsa-miR-5590-5p，其中hsa-miR-122-5p能靶向作用于MAPK1（mitogen-activated protein kinase 1，丝裂原激活的蛋白激酶1）、BCL2L1（BCL2-like 12（proline rich），BCL2样12（富含脯氨酸））、CDK4（cyclin-dependent kinase 4，细胞周期蛋白依赖性激酶4）等mRNA；Hsa-miR-3173-5p能靶向作用于CPEB4（cytoplasmic polyadenylation element binding protein 4，胞质聚腺苷酸化元件结合蛋白4）、SCAMP2（secretory carrier membrane protein 2，分泌载体膜蛋白2）、CAMKV（CaM kinase-like vesicle-associated，CaM激酶样囊泡相关）、ARHGEF2（Rho guanine nucleotide exchange factor（GEF）2，Rho鸟嘌呤核苷酸交换因子（GEF）2）。hsa_circ_0007995能海绵吸附hsa-miR-1254、hsa-miR-4534、hsa-miR-6751-5p、hsa-miR-99a-3p，其中Hsa-miR-4534能靶向作用于TMEM214（transmembrane protein 214，跨膜蛋白214）、EMC3（ER membrane protein complex subunit 3，ER膜蛋白复合物亚基3）、THAP1（THAP domain containing 1，THAP域包含1）、PER2（period circadian clock 2，周期生物钟2）、SEMA7A（semaphorin 7A，GPI膜锚）、CAPZA1（capping protein（actin filament）muscle Z-line，alpha 1，旋盖蛋白（肌动蛋白丝）肌肉Z线，alpha 1）、MAP1LC3B（microtubuleassociated protein 1 light chain 3 beta，微管相关蛋白1轻链3 beta）、ABCA6（ATP-binding cassette 6，ATP结合盒成员6）、PGM2L1（phosphoglucomutase 2-like 1，磷酸葡萄糖突变酶2样1）、TMOD3（tropomodulin 3，原肌钙蛋白3）、PPP2R1B（protein phosphatase 2，regulatory subunit A，beta；蛋白磷酸酶2，调节亚基A，β）、TMEM214（transmembrane protein 214，跨膜蛋白214）。novel_circ_0000402能海绵吸附hsa-miR-1273g-3p、hsa-miR-1285-3p、hsamiR-4304，其中hsa-miR-1285-3p能靶向作用于PRSS21（proteaseserine21，蛋白酶丝氨酸21）、MRI1（methylthioribose-1-phosphate isomerase 1，甲基硫代核糖-1-磷酸异构酶1）、UFM1（ubiquitin-fold modifier 1，泛素倍数调节剂1）。

3 circRNA的表达量 荧光定量PCR显示相对于新鲜红细胞组，储存20 d组的hsa_circ_0005413、hsa_circ_0008937、hsa_circ_0040340、hsa_circ_0003126、hsa_circ_0007995、hsa_circ_0023937、novel_circ_0000402、hsa_circ_0028281表达量显著下降（P＜0.05，表3）。其中novel_circ_0002503和hsa_circ_0049462未被RTPCR所验证，可能因为其片段比较短。

表3 circRNA的qRT-PCR表达结果（，n=5）

表3 circRNA的qRT-PCR表达结果（，n=5）

4 miRNA的表达量 由于circRNA能海绵吸附miRNA，而miRNA能靶向作用于mRNA的性质，许多研究证实了竞争性内源RNA-（competing endogenous RNAs，ceRNA）机制的存在。根据ceRNA机制原理，circRNA和mRNA的表达量变化应是同一方向，而circRNA和miRNA的表达量变化应是相反方向。之前的芯片研究揭示了红细胞储存中miRNA的表达量变化[9]。本研究在生物信息学预测到的miRNA中，选取了在芯片中表达量升高的miRNA做qRT-PCR验证。荧光定量PCR显示相对于新鲜红细胞组，储存20天组的hsa-miR-7160-5p、hsamiR-122-5p、hsa-miR-4534的表达量显著上升（P＜0.05，表4）。

表4 miRNA的qRT-PCR表达结果（，n=5）

表4 miRNA的qRT-PCR表达结果（，n=5）

5 mRNA的表达量 在生物信息学预测结果基础上，对预测得到的靶mRNA查阅大量文献。筛选出在储存损伤中发挥重大作用的3条mRNA进行RT-qPCR验证。荧光定量PCR显示相对于新鲜红细胞组，储存20 d组的CASP8、CDK4、TMOD3显著下降（P＜0.05，表5）。

表5 mRNA的qRT-PCR表达结果（，n=5）

表5 mRNA的qRT-PCR表达结果（，n=5）

6 与储存损伤有关的circRNA-miRNA-mRNA通路分析 经过qRT-PCR验证及文献查阅，初步发现hsa_circ_0005413-hsa-miR-7160-5p-CASP8、hsa_circ_0040340-hsa-miR-122-5p-CDK4、hsa_circ_0007995-hsa-miR-4534-TMOD3轴，参与了储存损伤的生物学过程。

讨 论

本研究从circRNA-miRNA-mRNA网络角度为红细胞储存损伤机理和预防提供了新见解。hsa_circ_0005413-hsa-miR-7160-5p-CASP8、hsa_circ_0040340-hsa-miR-122-5p-CDK4、hsa_circ_0007995-hsa-miR-4534-TMOD3轴是本文全新发现。这3条轴的miRNA分子中，暂未有hsa-miR-7160-5p的研究，miR-122在肝脂肪变性中上调，与衰老相关，并在多种人体组织中过表达[11-13]，hsa-miR-4534在健康人和2型糖尿病血清样本中的表达有显著差异[14]。这3条轴中的mRNA分子中，caspase-3和-8在成熟红细胞大量存在，由于存在这些蛋白酶，缺少线粒体凋亡级联反应的必需成分如caspase-9、Apaf-1和细胞色素c的红细胞可以进入凋亡途径[15]。细胞周期蛋白依赖性激酶4（cyclindependent kinase 4，CDK4）在人红细胞中存在，CDK4抑制剂能减弱氧化应激下的PS暴露，降低红细胞凋亡率[16]。（Tropomodulin3，TMOD3）是一种结合并覆盖在红系和非红系细胞的肌动蛋白丝尖端的蛋白质，TMOD3的破坏会使红细胞生成受损，它介导的肌动蛋白重塑对于成红细胞-巨噬细胞粘附，协调细胞周期与分化以及F-肌动蛋白组装和成红细胞去核过程中的重塑中起着重要作用[17]。另外TMOD3对肌动蛋白丝的覆盖不足可能会导致尖端的肌动蛋白动力学更大，丝长重新分布导致血影蛋白-肌动蛋白网状结构连接不规则和减弱，导致红细胞膜不稳定[18]。可以初步推测，hsa_circ_0007995可通过吸附hsa-miR-4534下调TMOD3的表达导致红细胞膜不稳定性增强。hsa_circ_0005413吸附hsa-miR-7160-5p，下调CASP8的表达阻止红细胞凋亡通路，hsa_circ_0040340能吸附hsa-miR-122-5p下调CDK4的表达，降低红细胞凋亡率。hsa_circ_0005413和hsa_circ_0040340可能是潜在的延缓储存损伤的有益基因。

根据本研究的生物信息学预测结果，未经过RT-qPCR验证的hsa_circ_0005413-hsa-miR-6871-5p-BACH1、hsa_circ_0005413-hsa-miR-6871-5p-SOD2、hsa_circ_0040340-hsa-miR-122-5p-MAPK1、hsa_circ_0040340-hsa-miR-122-5p-BCL2L1、hsa_circ_0007995—Hsa-miR-4534-PER2、hsa_circ_0007995—Hsa-miR-4534-SEMA7A途径有可能在红细胞生理过程发挥了重要作用。例如，转录因子Bach1可能参与成红细胞对缺铁状态的反应，它通过与血红素的直接结合而失活[19]。血红素通过转录因子Bach1在红系细胞中正调控基因座控制区域的β-珠蛋白表达[20]。超氧化物歧化酶2（super oxide dismutases，SOD2）缺乏将导致小鼠红细胞变形能力降低和血红素降解增加[21]。红细胞祖细胞中SOD2的丢失会导致蛋白质氧化损伤增强，膜变形改变以及红细胞存活率降低[22]。丝裂原相关蛋白激酶1（mitogen-associated protein kinase 1，MAPK1），成红细胞巨噬细胞蛋白（Emp）在红细胞和巨噬细胞中均表达，Emp的下调会影响丝裂原相关蛋白激酶1（MAPK1）和胸腺瘤病毒原癌基因（AKT-1）的表达，从而导致细胞运动异常[23]。Bcl-2样蛋白1（BCL2L1）属于抗凋亡因子，有间接证据表明bcl-x可能在红系细胞的凋亡中起作用[24]。有研究表明，将c-MYC和BCL-XL转导至多能造血祖细胞中过表达，使糖蛋白A（+）成红细胞能够持续自我复制[25]。周期生物钟基因Per2（Period circadian clock genes 2，Per2）具有非昼夜节律功能，Per2耗竭导致红细胞代谢谱发生重大变化，包括乳酸增加和ATP水平降低，所以它的丢失会大大减少红细胞的寿命[26]。JMH血型系统由6种位于Sema7A蛋白上的抗原组成，（Semaphorin 7A，Sema7A）是携带JMH血型抗原的蛋白质，参与免疫反应，在轴突生长和引导中起重要作用[27]。

除此以外，有些靶mRNA还能诱导circRNA环化，即促进circRNA的生成。如真核生物起始因子4A3（Eukaryotic initiation factor 4A3，EIF4A3）可诱导circMMP9环化，并增加了多形性胶质母细胞瘤细胞中circMMP9的表达[28]。这种调控机制是否在红细胞储存损伤中发挥作用还需要进一步研究。

在本文中，选取了高通量测序对circRNA分子进行研究。首先，选取下降明显的十个circRNA做PCR验证，其次用circBase和mirTarBase完成数据库注释与靶向预测，推测了circRNA海绵吸附miRNA的潜在功能。第三，将miRNA可能作用的mRNA也进行了关联分析，构建了circRNA-miRNA-mRNA通路。本研究的一个局限是，并未对所有差异表达的circRNA进行PCR验证和靶基因预测分析。但是我们的数据为红细胞储存损伤中的circRNA分子机制研究提供了新基础，并发现某些circRNA可能与储存损伤密切相关。利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突