去白悬浮红细胞4℃储存不同时间的质量评价

田雅娴 詹林盛 王小慧 田兆菊

红细胞是目前最常用的成分血，其输注的适应症包括症状性贫血、急性镰状细胞危象和超过30%血量的急性失血等，主要目的是恢复组织供氧[1]。美国FDA规定使用添加剂（AS-1，AS-3，AS-5等）红细胞在体外保存可长达42天，但多项研究显示，储存红细胞输注会引发细菌感染[2]、血管外溶血[3]、炎症[4,5]、脓毒症[6]和血栓形成[2,7]，且与特殊类型患者的不良预后具有显著相关性[5,8]。红细胞在储存过程中会发生一系列生物化学和生物力学改变，称之为“储存损伤”，包括腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）、2,3－二磷酸甘油酸（2,3-diphosphoglycerate，2,3-DPG）耗竭，pH值降低，钠钾离子浓度等生化指标改变，膜蛋白脂质过氧化，糖酵解速率降低，囊泡形成以及红细胞形态改变等[1,9–12]。除储存损伤外，献血者的红细胞并不是一个质量相等的成分血，存在供者与供者之间的变异，因此这是输血实践中一个值得关注的问题。储存损伤诱发输血安全的机制目前尚不明确，可能与红细胞储存损伤相关分子模式（DAMPs）潜在启动受体的免疫系统、细胞因子的累积、循环非转铁蛋白结合铁（NTBI）增加以及补体系统的激活等有关[1,9,13]。对于特殊的血液病患者如镰状细胞贫血[14]、β-地中海贫血[15]等，其疾病的特征是红细胞的病理变化的结果，包括红细胞组成成分的改变、膜受体和细胞骨架破坏，红细胞的形状、变形性和流变学特性的变化等。这些与疾病相关的红细胞变化似乎与输血前冷藏时红细胞的变化有一些相似之处，具有潜在的临床输血危害[16]。储存红细胞的实际年龄因供体特征、储存条件和储存期间的生物学变化而变化，因此阐明贮存过程中红细胞的质量及成分变化可能比存储日期更能真实反应红细胞的年龄，对于改善血液质量引发的临床输血后果应具有潜在价值[17]。根据国家标准“全血及成分血质量要求”（GB18469-2012），通过检测溶血率、血红蛋白含量、血细胞比容、无细菌生长等作为指标反映储存红细胞的质量。笔者认为，这些指标较为常规、单一，不足以反映红细胞在储存过程中的诸多质量参数的变化，需要更加全面、完善的质量评价技术对其进行综合评价。我们选择储存的去白悬浮红细胞进行质量研究，旨在探讨不同储存期限的红细胞的质量变化，并据此综合判断一定储存期限的红细胞是否会造成输注无效等不良后果。基于此，我们对4℃下不同储存时间红细胞的溶血率、细菌生长、生化指标、能量代谢、膜损伤及氧化应激等指标进行监测，以评价储存去白悬浮红细胞质量，以期提升其输注安全性，为临床红细胞输注前的血液质量提供参考数据。

材料与方法

1 材料与仪器 10份50 mL志愿者全血及一次性使用塑料血袋（内含红细胞保存液（MAP保存液），四川南格尔生物科技有限公司）由解放军总医院第七医学中心输血科提供，血液样本来源为18～25岁健康男性志愿者。微量游离血红蛋白（FHb）测定试剂盒（南京建成，批号：20200901），增强型ATP检测试剂盒（碧云天，批号：080219191112），Human 2,3-DPG ELISA KIT（成志科为，批号：Oct 2020），FITC偶联Annexin-V凋亡检测试剂盒（BD，批号：9312842），FITC anti-human CD47（BioLegend，批号：B286157），人丙二醛（MDA）ELISA试剂盒（上海江莱生物技术有限公司，批号：JL202105009），SOD（超氧化物歧化酶）试剂盒（南京建成，批号：20201007），全自动血细胞分析仪（BC-5130 深圳迈瑞公司），全自动生化仪AU5800（美国贝克曼诊断有限公司），多功能酶标仪（SpectraMax M5美国Molecular Devices公司），白细胞过滤器（美国Pall公司），细胞计数仪（上海睿钰生物科技公司），pH计（S210-8 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）

2 去白悬浮红细胞制备及检测 10份50 mL全血于采集当天经白细胞过滤器滤除白细胞后，3 000 r/min离心10 min去除大部分血浆层，临床上200 mL全血对应红细胞保存液约为50 mL，因此我们按全血保存液体积比为4∶1的比例加入红细胞保存液，颠倒混匀制备去白悬浮红细胞悬液，装入转移袋内密封后置于4℃保存，于第0、7、14、21、28、35和42天检测溶血率、生化指标、能量代谢指标、氧化损伤指标、膜损伤指标及红细胞膜表面分子，第0、14、28和42天检测细菌生长情况。

3.1 溶血率：于检测当天从血袋中取出1 mL血样，取样前充分混匀血液。全自动血细胞分析仪检测血常规各项指标，然后离心取上清，按照游离血红蛋白检测试剂盒说明书测定去白悬浮红细胞中FHb含量。根据公式：红细胞溶血率（%）=（1–红细胞比容）×悬浮液游离血红蛋白浓度/总血红蛋白浓度×100% 计算不同储存时间的红细胞溶血率。

3.2 细菌生长：按表1中成分用去离子水定容至l L配制培养基，高压蒸汽灭菌待温度降至50℃时取出，倾注约8 mL培养基至60 mm×15 mm的细胞培养板，冷却后凝固待用。采用四区划线法取血接种，严格无菌操作，同时设定阳性对照和阴性对照，37℃培养5天观察结果。

表1 培养基配制

3.3 生化指标：生化指标Na+（钠离子）/K+（钾离子）/GLU（葡萄糖）/LDH（乳酸脱氢酶）由全自动生化分析仪检测，pH值采用pH计测定。

3.4 能量代谢指标：采用荧光素酶催化荧光素产生荧光时需要ATP提供能量和人2,3-二磷酸甘油酸（2,3-DPG）ELISA法分别测定红细胞裂解液中ATP和2,3-DPG含量（按照试剂盒说明书进行）。

3.5 膜损伤指标：采用FITC偶联Annexin-V凋亡检测试剂盒检测红细胞储存过程中表面磷脂酰丝氨酸（PS）外翻情况。取储存去白悬浮红细胞，3 000 r/min离心5 min，从下层吸取1 μL纯红细胞，用PBS重悬稀释计数2×106个/mL。分别将FITC Annexin V和FITC anti-human CD47各5 μL加入100 μL 1×Bind buffer和100 μL PBS中，重悬细胞，室温避光孵育20 min。PS测定管加400 μL 1× Bind buffer直接上机检测，CD47测定管加1 mL PBS重悬洗一遍去除多余抗体，再用500 μL PBS重悬，上机检测。采用FlowJo V10软件分析结果，PS测定结果以标记率（Annexin V-FITC Labeled Rate/%）表示，CD47测定结果以平均荧光强度（mean fluorescence intensity，MFI）表示。

3.6 氧化应激指标：红细胞内SOD活力测定采用WST-1法，MDA含量采用ELISA法，操作按照试剂盒说明书进行。

4 统计学处理 采用GraphPad Prism 7软件进行数据做图及处理。统计学分析采用单因素方差分析和Tukey多重比较，对各指标不同储存天数的均数进行两两比较，根据P值判断两个均数之间是否具有统计学差异，溶血率及各生化指标以平均值±标准差（）表示，其余指标不同储存天数间的统计学差异以*表示，P<0.05视为差异有统计学意义。

结 果

1 溶血率及血常规检测结果 随储存时间的延长游离血红蛋白含量增加，与0天相比，储存第7天开始有统计学差异（P＜0.05），并随储存时间延长差异更加显著。储存终末期，即42天，溶血率升高至0.4%左右（P＜0.001）。血常规显示随储存时间延长RBC计数、HGB含量及HCT升高，HGB在42天出现统计学差异（P＜0.001）。MCV、MCH、MCHC无明显改变，RDW-CV和RDW-SD均升高，35和42天时RDWSD差异出现统计学意义（P＜0.001），表明随储存时间的延长红细胞大小的变异程度出现改变。

从理论上讲，预防腐败必须形成两个方面的约束体系：一是制度约束，从制度上规范和监督权力的运行，形成“不能腐”的体制机制；二是“道德心理约束”，从孝廉文化建设方面使官员形成“不想腐”的孝廉心理，能够自觉履行廉洁从政的政治道德要求。可以结合当地长期以来形成的孝廉文化传统，对干部群众进行“入情入理入脑入心”的宣传、感化、熏陶、教育，在全社会形成“腐败可耻”“一人腐败、全家倒霉”的孝廉文化氛围。

图1 去白悬浮红细胞储存过程中FHb及溶血率变化

表2-1 去白悬浮红细胞储存过程中血常规检测结果

表2-2 去白悬浮红细胞储存过程中血常规检测结果

2 细菌生长 4℃下冷藏储存条件下，各储存时间组去白悬浮红细胞均无细菌生长，符合《全血及成分血质量要求》。

图2 去白悬浮红细胞储存过程中细菌生长情况

3 生化指标检测结果 观察4℃下不同储存时间血液样本中的生化指标发现，Na+、GLU、pH随储存时间延长而下降，K+、LDH含量升高。其中，Na+、GLU变化无统计学差异，储存第42天时K+含量增加了近12倍，且差异有统计学意义（P＜0.001）。LDH含量增高，第21天时上升至新鲜时的1.5倍（P＜0.001），21、28、35和42天与0天相比，均具统计学差异（P＜0.001）。pH值随储存时间的延长而降低，且从第7天开始差异具有统计学意义（P＜0.001）。

4 能量代谢指标检测结果 与新鲜去白悬浮红细胞相比，ATP在储存第14天开始下降显著，至第21天降至初始值的36.4%，储存终末期降至初始值的13.2%，差异有统计学意义（P＜0.001）。2,3-DPG在储存第七天稍增高，而后开始下降，至第28天降至初始值的57.5%，差异具有统计学意义（P＜0.001），随储存时间的延长继续降低，到储存终末期降至初始值的44.0%，差异具有统计学意义（P＜0.001）。

表3 去白悬浮红细胞储存过程中生化指标检测结果

图3 去白悬浮红细胞储存过程中ATP、2,3-DPG含量变化

5 膜损伤指标检测结果 如图4所示，红细胞在储存过程中PS外翻率缓慢升高，与0天相比，储存21天时外翻率增加了12.7倍（0.03% vs.0.38%），储存终末期时升高了27.7倍（0.03% vs.0.83%），与0天相比有统计学差异（P＜0.001）。虽在储存过程中PS外翻率升高，但数值均在1.5%以下。另外，第7天开始红细胞膜表面的CD47分子平均荧光强度显著下降，下降至约为新鲜红细胞的59.1%（P＜0.001），14、21、28、35及42天相比较7天变化不显著。

图4 去白悬浮红细胞储存过程中PS外翻、CD47分子变化情况

6 氧化应激指标检测结果 红细胞内MDA含量无明显变化，第28天开始SOD活力显著下降，与新鲜红细胞相比差异具有统计学意义（P＜0.001），35天、42天与第28天相比无统计学差异。

图5 去白悬浮红细胞储存过程中MDA、SOD含量变化

讨 论

输血是临床上抢救患者的重要手段，去白悬浮红细胞输注降低了输血过程中白细胞和血小板引起的炎症反应，针对需长期进行输血的疾病如再生障碍性贫血、地中海贫血等以及因反复输血而引发非溶血性的发热反应的患者来说是十分理想的红细胞成分血。研究表明，红细胞的储存损伤是导致其输注风险的主要原因，储存的衰老红细胞会被单核/巨噬细胞系统清除。单核吞噬细胞系统对储存损伤的红细胞的急性大量清除会使得红细胞释放大量的Fe2+，超过转铁蛋白的承受能力，导致循环中出现非转铁蛋白结合铁，游离铁存在于血浆中是具有高度活性的，可以参与多种氧化还原反应，产生多种活性氧（ROS）和脂类过氧化产物诱导氧化应激，循环中增加的铁还会提高某些病原体的增殖能力诱导炎症反应[18]。同时，细胞内大量的铁会引起一些副反应：巨噬细胞内的铁含量与受到各种炎性刺激时分泌的细胞因子水平密切相关。以上提示储存红细胞通过表面抗原发生改变，释放促氧化剂及炎症性分子。到目前为止，虽然储存损伤对红细胞临床输注的安全性和有效性的影响并无定论，但大量证据表明，储存红细胞输注能诱导创伤后炎症及感染的增强，提升机体发生脓毒血症及导致感染性并发症的风险。储存后红细胞变形能力的损害可能导致输血后受者体内微循环的损害。红细胞的储存的时间应该加以考虑，以防止微循环损伤和组织输送氧气不足等问题的发生[19]。因此，开展储存红细胞质量检定及功能评价对输血的有效性和疗效具有重要意义。

本研究检测了储存过程中去白悬浮红细胞的溶血率、细菌生长、生化、能量代谢、膜损伤以及氧化损伤等指标评价红细胞质量。研究发现，随储存时间的延长溶血率增高，前28天升高缓慢，35天和42天变化显著。根据血常规参数，红细胞在储存过程中RDW-SD升高，表明红细胞大小出现变化，这可能与储存过程中膜通透性改变引起的细胞内外渗透压变化有关。生化指标Na+、GLU和pH值会随储存时间延长检测值下降，而K+、LDH含量升高。高浓度K+输入人体内可能引发高钾血症，这是一种急危重症严重者危害患者生命。因此储存时间久的去白悬浮红细胞中K+过高不宜输注。Flatt等报道，储存过程中的阳离子渗漏与红细胞MCV、RDW、PS外翻、膜囊泡形成以及红细胞膜的氧化损伤显著相关[20]。另一方面，红细胞膜表面有Na+-K+-ATP酶（钠钾泵），可分解ATP获得能量。正常生理功能条件下，钠钾泵会将3个Na+泵出胞外，同时泵入2个K+，从而维持细胞内外渗透压和正常的膜电位。但随红细胞储存时间延长，ATP消失殆尽，钠钾泵无法继续工作，导致胞内低钠高钾和胞外高钠低钾的情况改变，因此实验结果中胞外血清钠离子浓度降低，钾离子浓度上升的现象可能也会由此引发。较Na+而言K+变化显著，可能是由于在储存过程中膜上的离子通道被破坏，导致胞内高浓度的K+流入上清中，而Na+离子主要在细胞外，所以引起K+的显著变化。

细胞糖酵解的速率和温度、2,3-DPG含量和pH值有关，其中最重要的是pH值。细胞糖酵解生成ATP的同时也会产生乳酸和H+，从而随储存时间延长出现pH下降的改变，我们的实验结果也验证了这一结论。ATP是红细胞储存损伤的重要变化之一，红细胞ATP的含量与输血后恢复有显著的相关性。ATP含量降低会增强红细胞磷酸戊糖旁路代谢途径，产生大量的NADPH，抑制谷胱甘肽从而抑制红细胞的抗氧化能力。2,3-DPG除是红细胞糖酵解中间产物反映糖酵解速率外，还是评价红细胞携氧功能的有效指标之一，2,3-DPG的水平变化影响血红蛋白与氧的亲和力。同时2,3-DPG 还会降低细胞膜变形能力，影响红细胞膜的稳定性。本研究发现ATP储存第二周开始下降显著，第21天降至初始值的36.4%，储存终末期降至初始值的13.2%。储存第一周，红细胞内2,3-DPG含量稍升高，随后降低。2,3-DPG也是在第14天之后就出现明显降低，第28天降至初始值的57.5%。Bennett-Guerrero E等[21]报道红细胞内2,3-DPG在储存1周时基本完全消失，顾光煜等[22]用比色法研究发现，不同的保存液红细胞内2,3-DPG含量差异显著，ACD保养液储存第14天时2,3-DPG便已检测不出，而CPD-AI-DHA-Vit.C保养液保存至42天时，红细胞内2,3-DPG仍然保持在初始水平。张瑞君等[23]用酶标仪测定时发现，从第14以后2,3-DPG出现明显的下降趋势，与我们的实验结果一致。因此我们推测实验结果的差异可能是实验方法或保存液使用不一致引起。据报道，ATP与2,3-DPG含量变化与细胞内氧化应激具有显著相关性，两者含量下降会诱导胞浆内抗氧化物质的形成，最终结果是保护膜脂质及蛋白质的氧化损伤[24]。

MDA是评价红细胞氧化损伤、反应红细胞膜脂质过氧化的主要标志。SOD是红细胞抗氧化防御系统主要的标志性抗氧化酶，反映红细胞清除氧自由基的能力。MDA和SOD联合使用可反映红细胞的氧化损伤程度。本研究结果显示，红细胞在储存过程中MDA含量无明显改变，与文爱清等人[25]报道的随着储存时间的延长，MDA含量显著增加结果不一致。MENG等人[26]发现随储存时间延长，MDA含量并未升高，与0天相比，各储存阶段差异无统计学意义，与本研究结果一致。SOD在储存第28天时显著下降，说明红细胞在储存过程中出现氧化损伤，但结合MDA检测结果，后续需要增加红细胞内活性氧、谷胱甘肽、谷胱甘肽过氧化物酶以及过氧化氢酶等指标及增加样本量进行验证。美国FDA规定，储存红细胞在输注24小时后在受者循环系统中的回收率（即post transfusion recovery，PTR）应≥75%。储存的衰老或损伤的红细胞进入机体后主要被巨噬细胞清除，机制主要有以下几种：band 3蛋白介导的红细胞清除；磷脂酰丝氨酸（PS）介导的红细胞清除；CD47介导的红细胞清除等[27,28]。PS和CD47是反应红细胞清除的主要指标，CD47分子是一种免疫球蛋白超家族蛋白，是信号调节蛋白α（SIRPα）的配体，这两种蛋白共同构成了CD47-SIRPα信号系统。红细胞上的CD47分子与巨噬细胞上SIRPα受体的相互作用可以阻止巨噬细胞的吞噬作用，因此CD47减少或缺陷都会提高红细胞的清除率，决定红细胞的寿命[29–31]。因此我们检测了储存红细胞表面的PS外翻率和CD47分子平均荧光强度，与体内输注后红细胞的清除相对应。本研究显示，随储存时间的延长，PS外翻率升高差异有统计学意义，但外翻率均在1.5%以下，对其介导的体内吞噬性细胞对其清除的增加可能并不明显。CD47分子在储存7天时平均荧光强度显著下调，与J.Kamhieh-Milz等[32]的研究结果基本一致，他们也发现随储存时间的延长，CD47分子的表达水平降低，第7天时变化最为显著，与新鲜红细胞相比具有统计学差异。据此推测储存终末期去白悬浮红进入机体内后，可能因CD47分子下调表达而诱导更多的单核/巨噬细胞系统对其的体内清除，造成PTR下降从而影响输血治疗的有效性。值得注意的是，本研究中因条件所限，样本量较少，扩充样本量后的实验结果应更为精准可靠。

总的来说，储存去白红细胞质量随储存时间的延长而发生变化，表现为溶血率增加，ATP、2,3-DPG含量降低，PS外翻率增加，细胞膜表面CD47分子表达下调，无明显氧化损伤。我们对检测溶血率、细菌生长、生化、能量代谢、清除以及氧化应激指标等的变化结果进行综合分析，推荐去白悬浮红的最佳储存期限为14天。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突