储存红细胞中circRNA变化对泛素介导蛋白水解通路调控的预测分析*

张怡宇 黄国清 张勇刚 苑召虎 王强 陈小洁 黄建云 李楠 魏亚明

国内红细胞一般在血库条件下可保存35天，在这个过程中，会发生储存损伤，继而储存损伤会影响红细胞的寿命及输注质量。红细胞内蛋白质发生降解也是储存损伤中的重要现象之一。泛素介导的蛋白水解通路是细胞质依赖于ATP的非溶酶体途径的蛋白质降解通路[1]。泛素是一种热稳定蛋白质，通过与蛋白质的共价酰胺键结合将其降解[2]。在网织红成熟过程中，细胞膜的蛋白组成发生变化，其中微管蛋白和肌动蛋白发生降解，而这种降解部分由泛素-介导的蛋白水解途径实现。不仅如此，它还能降解红细胞中的游离α-珠蛋白、变性异常的蛋白质，而且能降解细胞转录因子、细胞内膜蛋白和细胞周期蛋白等天然蛋白质[2-4]。泛素相关的酶主要包括：泛素激活酶E1，泛素载体蛋白E2和泛素蛋白连接酶E3，不同E3酶的底物特异性决定了哪些蛋白质能发生降解[5]。

环状RNA（circRNA，circular RNA）是一种比线性RNA更稳定的环形分子，是红细胞中转录组的天然组成部分[6]。有很多研究发现circRNA是miRNA海绵，通过多个结合位点吸附大量miRNA，从而解除miRNA对mRNA的抑制作用，促进mRNA表达[7，8]。circRNA在形成环化同时会影响其母基因生成线性RNA的丰度，从而达到调节母基因蛋白质翻译的目的。circRNA能与RBP（RNA binding proteins，RNA结合蛋白）特异性结合，发挥生物学功能。若circRNA发生聚集，由于其环形分子可产生三级结构，对与之结合的大量RBP不仅起到了分类隔区的支架作用，与mRNA比，也产生了其特有的与多组蛋白质结合的能力，能增加circRNA转录本的稳定性[9，10]。

本研究发现有近200个circRNA都与泛素降解的蛋白水解通路相关，相比其它代谢通路，这个数量非常巨大。基于此，本研究对母基因富集在泛素降解的蛋白水解通路的全部circRNA做了统计分析，挑选了组间相比具有统计学意义的部分circRNA进行PCR验证，并预测其作为miRNA的海绵功能和RBP结合的能力。

材料和方法

1 一般资料与实验分组 血液标本为5名25～30岁O型健康合格献血者的标本各200 mL，与CPDA-1保存液混合，过滤去除白细胞后制成悬浮红细胞，分别收集新鲜组0 d、20 d、40 d收集标本进行试验。收集方法如下：以（1 000×g，20 min，4℃）为条件进行慢速离心，在生物安全柜内将血浆层吸走，留取红细胞层，用PBS洗涤三次，尽可能去除血小板与血浆。其中3名健康者标本用来circRNA测序，所有5名健康者标本用来circRNA的RT-qPCR验证。研究获广州市第一人民医院医学伦理委员会批准（K-2018-027-01）。

2 试剂与仪器 红细胞保存液CPDA-1购自广州费森尤斯卡比；PrimeScript RT Master reagent Kit with gDNA Eraser（perfect Real Time）、SYBR Premix Ex Taq Master MixⅡ、无酶水均购自日本TaKaRa公司；TRIzol-LS购自美国life公司；RNaseR购自美国Epicentre公司；一次性白细胞过滤输血器购自美国pall公司；自动红细胞计数仪购自北京赛科希德公司；电热恒温培养箱购自上海精宏公司；低温高速离心机购自美国Eppendorf公司；引物序列由上海捷瑞合成；使用qTOWER2.2购自德国analytikjena的PCR仪做qRT-PCR检测。

3 circRNA高通量测序检测 5名健康者标本的新鲜红细胞和4℃储存20 d红细胞分别提取总RNA储存于–80℃，其中3份进行circRNA高通量测序。对0 d组、20 d组、40d组的9份标本（9份/组）做高通量测序。该测序用到了QIAquick PCR 纯化试剂（QIAGEN，Hilden，Germany），cDNA文库在Illumina HiSeqTM 4000（Illumina，San Diego，CA，USA）扩增和测序。

4 circRNA的生物信息学方法与流程 用KEGG和GO分析筛选出母基因在泛素介导的蛋白水解通路中的circRNA。将这些circRNA的类型、来源、新旧进行分析，最终完成其功能注释。用circBase（http：//circbase.org/）与mirTarBase（http：//mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/php/index.php）完成数据库注释与靶向预测。然后对cirRNA作用miRNA进行靶标预测，所用软件是mireap（http：//mireap.sourceforge.net/），miranda（https：//sourceforge.net/projects/mireap/），targetscan（http：//www.targetscan.org/vert_72/）。并将miRNA可能作用的mRNA也进行了关联分析，所用软件是mirTarBase（mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/php/index.php）。对circRNA预测其结合RBP的能力，所用软件是circRNA interactome（https：//circinteractome.nia.nih.gov）。本测序数据的fasta文件及fastq文件已上传至NCBI数据库，获取地址：https：//dataview.ncbi.nlm.nih.gov/object/PRJNA698240，https：//dataview.ncbi.nlm.nih.gov/object/PRJNA698384。

5 circRNA、miRNA、mRNA表达量的测定 测定miRNA 的相对表达量采用 qRT-PCR 方法，具体方法参考文献[11]。circRNA的引物如表1所示，miRNA及mRNA引物设计用软件prime3（http：//frodo.wi.mit.edu/primer3/）完成。

表1 qRT-PCR实验的引物

6 统计学分析 采用SPSS 16.0软件和Graphpad Prism5软件行独立样本t检验，数据以均数±标准差（）表示，P＜0.05表示差异有统计学意义。

结 果

1 测序结果分析 经KEGG分析和GO分析显示，储存红细胞中与泛素介导的蛋白水解通路相关的circRNA有近200种，其中大部分circRNA为未命名circRNA，即未被circBase数据库收录的novel开头命名的circRNA，由本次测序研究首次发现。20 d组与0 d（新鲜）组对比，统计学上表达上升的circRNA有：hsa_circ_0036044，hsa_circ_0024173，表达下降的有：hsa_circ_0007112，hsa_circ_0035729，hsa_circ_0035761，hsa_circ_0044231，40 d组与0 d（新鲜）组对比表达上升的有hsa_circ_0035731，表达下降的有：hsa_circ_0002502，hsa_circ_0004724，hsa_circ_0041555。40 d组与20 d组对比表达上升的有：hsa_circ_0019567，hsa_circ_0007112，hsa_circ_0035761，hsa_circ_0044231，hsa_circ_0028196，hsa_circ_0002814，表达下降的有：hsa_circ_0024173。（图1）。

图1 circRNA分组聚类图

表2 circular RNA统计表

2 生物信息学预测结果 利用circBase和mirTarBase软件预测，共发现 circRNA-miRNA 13组，其中hsa_circ_0036044能海绵吸附hsa-miR-6766-5p，hsa_circ_0024173能海绵吸附hsa-miR-25-3p，hsa_circ_0035761能海绵吸附hsa-miR-4530，hsa_circ_0044231能海绵吸附hsa-miR-1296-3p和hsamiR-5698，hsa_circ_0002502能海绵吸附hsa-miR-6085，hsa_circ_0004724能海绵吸附hsa-miR-3944-5p，hsa_circ_0041555能海绵吸附hsa-miR-433-3p，hsa_circ_0028196能海绵吸附hsa-miR-4299和hsamiR-7-5p，hsa_circ_0002814能海绵吸附hsa-miR-4675。hsa-miR-4530能靶向作用于TRAF2（TNF receptor-associated factor 2，TNF受体相关因子2），见表3。

表3 与circRNA结合的miRNA

circRNA interactome数据库预测显示，在泛素介导的蛋白水解通路里，具有统计学意义的大部分circRNA可结合多个RBP，只有2个circRNA仅结合一个RBP，即EIF4A3（eukaryotic translation initiation factor 4A3，真核翻译起始因子4A3），见表4。hsa_circ_0036044、hsa_circ_0007112、hsa_circ_0035729、hsa_circ_0035761、hsa_circ_0044231、hsa_circ_0028196、hsa_circ_0002814都与EIF4A3具有多个结合位点，有很强的结合能力。此外，hsa_circ_0028196和hsa_circ_0036044与U2AF65（U2 small nuclear ribonucleoprotein auxiliary factor 65，U2小核糖核蛋白辅助因子65）；hsa_circ_0028196与AGO2（argonaute RISC catalytic component 2，精氨酸RISC催化组分2）；hsa_circ_0028196与PTB（polypyrimidine-tract-binding protein，多嘧啶束结合蛋白）；hsa_circ_0002814与TDP43（TAR DNA binding protein 43，TAR DNA结合蛋白43）也具3个及以上的结合位点。

表4 与circRNA结合的RNA 结合蛋白（RBP）

3 qPCR验证的circRNA的表达 在泛素介导的蛋白石水解通路中具有统计学意义的circRNA共有13个，我们选取了有结合多个RBP或miRNA能力的6个circRNA做荧光定量PCR验证。显示相对于0 d（新鲜）红细胞组，储存20 d组的hsa_circ_0036044和hsa_circ_0024173表达量上升，hsa_circ_0035761表达量下降，且具有显著统计学意义。（P＜0.001，图2）。相对于新鲜红细胞组，储存40 d组的hsa_circ_0002502表达量下降，且具有统计学意义。（P＜0.05，图2）。相对于储存20 d组，储存40 d组hsa_circ_0024173表达量下降，且具有明显统计学意义。（P＜0.01，图2），hsa_circ_0035761和hsa_circ_0028196表达量上升，且具有显著统计学意义。（P＜0.001，图2）。

图2 circRNA的表达量变化（n=5）

4 qPCR验证预测的靶miRNA的表达 由于circRNA能海绵吸附miRNA，而miRNA能靶向作用于mRNA的性质，许多研究证实了ceRNA机制的存在。根据ceRNA机制原理，circRNA和mRNA的表达量变化应是同一方向，而circRNA和miRNA的表达量变化应是相反方向。hsa-miR-4530在储存红细胞芯片检测中存在[12]。荧光定量PCR显示相对于新鲜红细胞组，储存20 d组的hsa-miR-4530的表达量上升，且具有统计学意义（P＜0.001），储存40 d组相对于储存20 d组的hsa-miR-4530的表达量下降，且具有统计学意义（P＜0.001，图3）。

图3 miRNA的表达量变化（n=5）

5 qPCR验证的预测的靶mRNA的表达量 对hsa-miR-4530预测得到的靶mRNA，即TRAF2进行荧光定量PCR检测。显示相对于新鲜红细胞组，储存20 d组的TRAF2表达量下降（P＜0.01），储存40 d组相对于储存20 d组的TRAF2的表达量上升，且差异具有统计学意义（P＜0.001，图4）。

图4 mRNA的表达量变化（n=5）

讨 论

已有研究表明红细胞储存27天时，circRNA丰度高于相应mRNA的丰度，而且证实了红细胞是脱核后产生了大量的circRNA富集现象[13]。circRNA的产生更不是一个随机事件，在造血细胞中每个基因检测到的circRNA变体数量与每个转录本的外显子数量之间没有明显的相关性[14]。这些都暗示了circRNA有可能精细化调节红细胞储存损伤的生理过程。本研究选取了在储存损伤中发挥重要作用的泛素介导的蛋白水解通路的circRNA表达进行统计分析，发现了有近200个cirRNA的母基因富集在这条通路且具有显著统计学意义，相比其他通路而言数量十分巨大。有部分circRNA如hsa_circ_0036044、hsa_circ_0035729只在20 d与0 d对比时表达量变化明显，呈现了储存前期的变化。有部分circRNA如hsa_circ_0019567、hsa_circ_0028196、hsa_circ_0002814只在40 d与20 d对比时表达量变化明显，呈现了储存后期的变化。而hsa_circ_0035731、hsa_circ_0002502、hsa_circ_0004724、hsa_circ_0041555只在40 d时与0 d对比时表达量变化明显，呈现一个累积量变的过程。还有部分cirRNA如hsa_circ_0024173、hsa_circ_0007112、hsa_circ_0035761、hsa_circ_0044231在20 d与0 d及40 d与20 d两个储存阶段对比，表达量变化呈反向趋势。

一般认为储存损伤可由红细胞自身代谢产物积累、氧化损伤、红细胞凋亡渐增引起。细胞凋亡会激活胱天蛋白酶（半胱氨酸蛋白酶）的蛋白水解级联反应，该事件可导致细胞最终死亡。泛素介导的蛋白水解在细胞凋亡中发挥重要作用，无用的和破损的蛋白质都通过此途径降解，并通常需要消耗ATP。红细胞虽然没有核，但它仍能严格精细的执行mRNA翻译[15]，这些翻译同样存在不同程度的调控。本文发现hsa_circ_0035761能海绵吸附hsa-miR-4530，而hsamiR-4530又能靶向作用于肿瘤坏死因子受体相关因子2（TNF receptor-associated factor 2，TRAF2）。肿瘤坏死因子（TNF）是一种炎症因子，可通过激活两种不同的受体TNFR1和TNFR2发挥其功能。两种受体都可以激活经典的NF-κB和JNK MAP激酶信号传导，而TNFR2也可以激活非经典的NF-κB信号传导，导致与炎症、细胞增殖和细胞寿命相关的基因表达量发生变化[16]。TRAF2是TNF-α介导的c-Jun N末端激酶（JNK）激活所必需的，它有助于NF-kappaB的激活并介导抗凋亡信号[17]。在兔网织红细胞中，TRAF2可以与细胞凋亡蛋白1的抑制剂结合，抑制某些胱天蛋白酶（caspases）活性，控制某些促凋亡刺激物的表达量[18]。细胞凋亡蛋白1在细胞凋亡中发挥作用表现在能直接结合caspases，以及通过结合RING结构域激活E3泛素连接酶[18]。本研究推测在储存40 d比20 d时，由于红细胞的储存损伤明显加剧，hsa_circ_0035761出于抗凋亡作用，表达量明显增高，解除了hsa-miR-4530对TRAF2抑制作用，使TNFR2表达量增高。

本研究还表明很多circRNA具有多个RBP结合位点。真核翻译起始因子4A3（eukaryotic translation initiation factor 4A3，EIF4A3）是出现频率最高的RBP。最近的研究发现，乳腺癌中EIF4A3和E2F1可以促进circSEPT9的表达，而circSEPT9表达的增加与肿瘤晚期预后不良呈正相关[19]。EIF4A3通过与MMP9 mRNA转录物结合，诱导了circMMP9环化，增加了胶质母细胞瘤中充当致癌基因的circMMP9表达[20]。目前文献都证明了在各种通路及代谢过程中RBP具有促进circRNA生成表达的功能，并无抑制功能。而处于泛素介导的蛋白水解酶通路中多个circRNA表达量都增高的现象与它们具有多个RBP结合能力有待进一步研究。

本文选择了母基因富集在泛素介导的蛋白水解通路中的circRNA做相关预测研究，用PCR证实了它们及相关把分子的表达变化，它们不同的表达变化模式可能暗示了其有精细调节储存损伤机制。通过生物信息学预测下游的功能，初步展示了circRNA通过miRNA调控mRNA的生成途径，RBP促环化可能是其生成的调控机制。尽管母基因来源于泛素介导的蛋白水解通路中的单个circRNA并不一定作用于泛素介导的蛋白水解通路，但通过与母基因的调控关系去探讨它的功能是很主要的一部分。我们的数据为红细胞储存损伤中的circRNA分子机制研究提供了新研究视角，并发现某些circRNA可能与储存损伤中抗凋亡密切相关。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突