两例B（A）血型的检测及鉴定*

赵阳 胡晓玉 吕蓉 於娟 王超

ABO血型鉴定在临床输血、移植配型、新生儿溶血病检测等方面有着重要的意义。临床医院在进行ABO血型鉴定时，常常会检测出正反定型不符的样本，如亚型样本，甚至是一些较罕见的亚型样本，为临床输血及治疗带来一些困难。本文中鉴定的B（A）血型就是一种罕见的亚型，在我国的健康人群中B（A）型存在的概率约为8.3/10万[1]，探讨该类血型的鉴定方法以及对该类患者的临床用血指导均有着重要的意义。

材料与方法

1 样本来源 样本1：孕妇（39+4周），女，28岁，前往安徽医科大学第二附属医院就诊，拟行剖宫产手术。既往2017年剖宫产一次，无输血史，无移植史。该院输血科在对该孕妇血液样本进行术前常规ABO血型鉴定时发现正反定不符，正定为AB型，反定为B型。样本2：男，31岁，膝关节前十字韧带完全断裂，于合肥市第二人民医院住院治疗，无输血史，无移植配型史，术前常规ABO血型鉴定时发现正反定不符，正定为AB型，反定为B型。为确定该两例患者ABO血型，送检抗凝血和不抗凝血各5 mL至本室进行疑难血型鉴定。

2 试剂与仪器

2.1 仪器：离心机（日本久保田）；全自动磁珠提取纯化系统（Thermo）；电泳仪（北京六一）；全自动凝胶成像系统（SYNGENE）。

2.2 试剂：抗-A/抗-B（批号：201900712，上海血液生物医药有限责任公司）；反定型A1细胞、反定型B细胞、反定型O细胞（批号：8000262295，8000262295，8000262300，Sanquin Plesmanlaan Amsterdam公司）；抗-AB（批号：462000，DIAGAST）；抗-H（批号：K1327，Sanquin Plesmanlaan Amsterdam）抗-A1（批号：K1328，Sanquin Plesmanlaan Amsterdam）；A2细胞（批号：800045081，Sanquin Plesmanlaan Amsterdam公司）；磁珠法血液DNA提取试剂盒（批号：MD5111-02，Magen）；人类红细胞ABO血型-CisAB，B（A）基因分型试剂盒（PCR-SSP法）检测试剂盒（批号：K201902004，天津市秀鹏生物技术有限公司）；琼脂糖凝胶（批号：111860，BIOWESTE）。

3 方法

3.1 血型血清学检测：按《全国临床检验操作规程》（第4版）的操作方法进行试管法ABO血型正反定型以及抗-AB、抗-H、抗-A1、A2细胞的试管法凝集实验，于肉眼及显微镜下观察结果，并参照血型血清学诊断标准对检测结果进行判定。

3.2 分子生物学检测

3.2.1 DNA提取：抗凝血样采用磁珠法提取DNA，按照DNA提取试剂盒说明书和全自动磁珠提取纯化系统要求操作。检测DNA浓度为30～50 ng/mL，A260/A280值为1.6～2.0，DNA冻存于–20℃备用。

3.2.2 PCR-SSP方法检测：按照试剂说明书要求配制试剂，将混合液和20 μL DNA加入引物板中，混匀后加一滴石蜡油。根据说明书设置PCR扩增参数，将引物板覆膜后置于PCR仪进行扩增。按照试剂说明书中引物孔位图顺序，取PCR反应产物5 μL上样到琼脂糖凝胶中，150 V电泳15 min，紫外凝胶成像系统下拍摄成像，依据说明书进行实验结果判读。

3.2.3 ABO全基因组测序：委托天津市秀鹏生物技术有限公司对样本1的ABO基因1-7外显子进行测序。

结 果

1 血型血清学检测结果 送检样本的血清学检测结果显示正定型是AB型，反定型是B型，正反定型不符（表1），该反应格局符合B（A）血型血清学格局。

表1 2例样本的血型血清学检测结果

2 分子生物学检测结果 根据PCR-SSP试剂说明书的结果分型表判定，在第1B、2D、2F泳道[B（A）02型特征带]均出现目的条带，2G泳道[O1型特征带]出现目的条带，其余泳道均为阴性，判定样本1和2的表型均为B（A）02/O1（图1）。

图1 样本ABO基因PCR-SSP分型结果

3 基因测序结果（样本1）Exon 1、Exon 2、Exon 3、Exon 4和Exon 5测序均没有发现突变。Exon 6测序发现等位基因261出现碱基缺失杂合（图2），297A＞G杂合（图3）。Exon 7测序发现526C＞G、657C＞T、700C＞G、703G＞A、796C＞A、803G＞C和930G＞A杂合（图5～图9）。根据ISBT网站提供的Names for ABO（ISBT 001）blood group alleles v1.1 171023数据库，综合结果判定（以A101为参考序列）ABO*B（A）.02/O.01.01基因型。

图2 标本第6外显子c.261delG碱基缺失

图3 标本第 6外显子c.297A＞G杂合

图4 标本第7外显子c.526C＞G杂合

图5 标本第7外显子c.657C＞T杂合

图6 标本第7外显子c.700C＞G；c.703G＞A杂合

图7 标本第7外显子c.796C＞A；c.803G＞C杂合

图8 标本第7外显子c.930G＞A杂合

讨 论

ABO血型系统最早于1990年提出，至今在临床输血和器官移植等方面仍然有重要的意义。对临床患者和无偿献血者的ABO血型检测中常会发现ABO亚型，导致正反定型不一致。ABO亚型是指除了A型、B型、AB型和O型四种主要的表现型以外，人群中还有一部分AB血型的变异型。本文中探讨的B（A）血型在我国献血人群中的检出率约为1/（5～10）万，高于欧洲人种的1/（17～58）万[2]。2015年5月，人类血型基因突变库（BGMUT）已报道的B（A）等位基因有6种，其中B（A）02、B（A）04、B（A）05和B（A）06均首先在国内发现，以B（A）02和B（A）04等位基因频率最高[3]。B（A）04等位基因在上海地区献血人群中出现的频率约为1.6/10万，B（A）02等位基因约为0.78/10万[4]。在安徽地区曾有过2例B（A）04型的报道，本文中2例均为B（A）02型，为安徽地区首次报道，推测安徽地区人群中B（A）亚型也可能以B（A）04和B（A）02等位基因为主。B（A）表型是常染色体显性表型，其特征是B型红细胞上表达弱的A抗原[5]。B（A）型的形成机制是在正常B等位基因序列的基础上发生单或多碱基突变，变异的等位基因具有编码双功能活性酶的能力，所以血清学除了表现B抗原特异性，还表现少量A抗原特异性[6]。

B（A）血型血清学结果易误判为A亚B型[7]。本组病例正定型表现为抗A凝集强度为2+较弱，观察结果时易将凝集块摇散，抗B的凝集强度为4+，反定型A1细胞凝集强度为4+或较弱的凝集强度，B细胞和O细胞均不凝集，进一步应用抗-AB、抗-H、抗-A1、A2细胞等其他试剂进行血清学试验，红细胞与抗AB反应凝集强度为4+，与抗H反应凝集强度为4+，H抗原的含量较正常的B细胞强，与抗A1反应不凝集，血清与A2细胞反应凝集强度为1+或更弱的凝集，符合B（A）血型血清学格局[8，9]。

为进一步确定样本的ABO血型，PCR-SSP检测结果可判定为B（A）02/O1型。从测序结果来看1-5外显子碱基没有突变，第6号外显子261位碱基缺失杂合，297位碱基杂合，第7号外显子657、700、703、796、803和930G杂合，可推断有ABO*O.01.01和ABO*B（A）.02等位基因。与ABO*B.01相比，ABO*B（A）.02第7外显子上700位碱基发生了C＞G的突变，引起234位点脯氨酸突变成丙氨酸，导致266位甲硫氨酸和268位丙氨酸的空间构象发生变化，使糖基转移酶特性发生改变[10]。测序结果与本文中SSP的实验结果是一致的。

由于B（A）血型的患者容易误判为AB型，如输注AB型血液容易引起严重的输血反应。理论上B（A）血型患者输注同型血液或自身输血最为安全有效，但由于 B（A）型的罕见，B（A）血型在我国献血人群中的发生概率可能是1/50 000～1/100 000[11]，因此该血型患者在临床输血工作中很难实现同型血液输注。B（A）型患者的输血适用于ABO亚型输血通则，可以输注O型洗涤红细胞、AB型血浆和AB型血小板。既往认为最好输注O型洗涤红细胞，但在血清学试验中发现B（A）患者红细胞上的A抗原只与含 MH04的单克隆抗-A有凝集反应，而与人源抗-A并无反应，同时献血者血清中抗-B效价多在16～32，从体外血清学试验的结果来看，如果B型献血者血浆中的抗-A效价不是很高，B（A）血型患者与B型献血者交叉配血均是相合的，在血液紧缺或需紧急输血的情况下，可以考虑输注B型洗涤红细胞[6]。但配血相合的B型血浆是否会在患者体内破坏红细胞还有待进一步的研究。

血清学的方法在亚型的鉴定上还存在一定的局限性，单纯依靠血型血清学无法准确鉴定B（A）血型，采用血型血清学和分子生物学相结合的方法进行鉴定，能够提高鉴定准确率，可以较好的解决临床输血问题。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突。