三例伴有t（18；22）（q21；q11）慢性淋巴细胞白血病的细胞及分子遗传学研究*

向鑫 刘恒芳 曾招 白淑潇 岑建农 金松 沈宏杰 陈苏宁 潘金兰

位于18q21染色体上的BCL-2是一种癌基因，其蛋白具有抗凋亡功能，在肿瘤中通常发生过表达。在淋巴细胞增殖性疾病中，最常见的导致BCL-2过表达的机制为14和18号染色体易位，即t（14；18）（q32；q21），位于14q32的IGH基因与位于18q21的BCL-2基因并置，导致BCL-2基因过表达。此类染色体易位可见于80%～90%的滤泡淋巴瘤（follicular lymphoma，FL）和慢性淋巴细胞白血病（chronic lymphocytic leukemia，CLL）。而t（18；22）（q21；q11）核型比较少见，被认为是t（14；18）（q32；q21）的变异易位，分子研究发现，该异常导致BCL-2基因与位于22q11的IGL基因并置，同样导致BCL-2基因过表达。目前为止，本中心发现3例t（18；22）（q21；q11）异常核型病例，并对其进行了FISH和全基因组测序等研究，现将结果汇报如下。

资料和方法

1 实验方法

1.1 研究对象：我们回顾性筛查了2012年1月～2019年1月在苏州大学第一附属医院进行染色体检测的患者，3例为t（18；22）（q21；q11）异常，均为CLL，CLL的诊断符合《血液病诊断及疗效标准》[1]。

1.2 染色体检测：抽取患者骨髓或外周血，进行DSP30+IL-2刺激剂的培养，按常规方法制备染色体，再进行R显带和常规染色体核型分析。根据2016年国际人类细胞基因组命名体制[2]描述克隆性核型异常。

1.3 荧光原位杂交（FISH）检测：例1患者复查时进行了CLL组套（13q14/Rb1，p53，cen12，ATM）和BCL-2重排的FISH检测，例2和例3患者初诊时均进行了BCL-2重排的FISH检测，其中例3患者同时进行了CLL组套FISH。至少分析300个间期核细胞。利用OLYMPUS BX51荧光显微镜（日本OLYMPUS）捕获FISH信号，并用VideoTest-FISH 2.0成像软件（俄罗斯）扫描和捕获图像。

1.4 全基因组测序：例1患者的DNA被送至上海天昊公司进行人全基因组测序，gDNA文库构建使用Illumina公司生产的TruSeq Nano DNA HT Sample prep Kit，按照厂家的标准流程进行。根据断裂位点设计引物，采用PCR方法扩增，然后通过DNA电泳验证断裂位点。

2 临床资料

2.1 例1患者：男性，64岁。2019年1月于本院门诊就诊，行骨穿进行检测，骨髓细胞形态学显示骨髓增生明显活跃，淋巴细胞比例明显增高占91.5%；骨髓淋巴细胞免疫分型显示，可见82.1%的成熟克隆性B淋巴细胞为 CD5+、CD19+、CD20+、κ+、CD23±、FMC7±、CD10–、CD38–、λ–；患者同时检测淋巴结组织免疫表型，结果与骨髓细胞免疫表型一致，具体结果见表1；二代测序显示DNMT3AT突变；诊断为CLL。

表1 3例患者细胞免疫表型检测结果

2.2 例2患者：外院送检患者，男性，65岁。2018年11月初诊时，骨髓淋巴细胞免疫分型显示，49.2%的成熟克隆性B淋巴细胞为CD5+、CD19+、CD23+、CD10–、CD38–、FMC7–、κ–、CD20±、λ±，结果见表1；多重PCR结果阴性；IG基因重排阳性，TCR基因重排阳性；诊断为CLL。

2.3 例3患者：女性，44岁。2010年9月于本院门诊就诊，骨髓细胞形态学显示淋巴细胞增殖性疾病可能，成熟淋巴细胞84.5%；骨髓淋巴细胞免疫分型显示，94.6%的成熟克隆性B淋巴细胞为CD5+、CD19+、CD20+、CD23+、CD10–、CD38–、FMC7–、κ–、λ–。2015年4月再次对骨髓细胞进行免疫分型检测，发现97.1%的成熟克隆性B淋巴细胞为CD5+、CD19+、CD20+、CD23+、CD10–、CD38–、FMC7–、κ–、λ+，与初诊结果相比，初诊时λ阴性，复查时λ转为阳性，其它结果一致。2018年10月检测IGHV突变率为9.7%。

结 果

1 染色体检测 例1患者在初诊和治疗期间共行2次染色体检测。初诊时5个细胞为t（18；22）（q21；q11）同时伴有+12和体质性inv（9）异常，2个细胞为唯一inv（9）体质性异常；治疗9个月后染色体结果仍旧没有改变，6个细胞为唯一inv（9）异常，4个细胞为t（18；22）（q21；q11）同时伴有+12和inv（9）。例2患者初诊时10个细胞均为t（18；22）（q21；q11）异常，治疗6个月后3个细胞为t（18；22）（q21；q11）异常（图1），17个细胞正常。例3患者初诊时为正常核型，治疗4年6个月后复查染色体，5个细胞为唯一t（18；22）（q21；q11）异常，2个细胞同时伴有13q–，3个细胞为正常核型，至2019年11月复查染色体已进展为伴有t（18；22）的复杂异常。

图1 例2患者R显带染色体核型图：46，XY，t（18；22）（q23；q11）

2 FISH 检测 例1患者复查时CLL组套FISH结果为+12阳性75%，其余为阴性；BCL-2重排阳性25%。例2患者初诊时BCL-2重排阳性60%，未行CLL组套FISH检测。例3患者初诊时CLL组套FISH检测结果为13q–阳性51%，Rb1缺失阳性44%，其余为阴性；BCL-2重排阳性73%（图2），治疗后2次CLL组套FISH检测结果仍旧为13q–阳性，比例分别为86%（Rb1 88%）和78%（Rb1 75%）。

图2 例3患者骨髓细胞FISH结果

3 全基因组测序 例1患者DNA全基因组测序结果显示累及18号和22号染色体（图3）。18号染色体受累基因为BCL-2，22号染色体受累基因均为IGLL5。在DNA水平对基因测序结果进行了验证，确定为BCL-2与IGLL5出现并置，并且RNA水平未发现有RNA转录本。

图3 例1患者DNA全基因组测序结果

4 治疗经过 例1患者诊断后予以口服留可燃治疗，效果不佳，改用伊布替尼治疗，口服伊布替尼1个月，因血小板下降，予以停用。定期复查血象，提示白细胞计数升高，随后间断口服伊布替尼治疗。2019年10月因出现发热，予以骨穿复查，形态显示骨髓增生明显活跃，淋巴细胞比例偏高占91%。淋巴细胞免疫分型显示91.0%的CD5+CD10–成熟克隆性B淋巴细胞。后患者因医保问题自行出院，未继续治疗。目前门诊随访，血象控制不佳。例2患者诊断后予以3个疗程FC方案治疗，2019年4月复查，骨髓淋巴细胞免疫分型未见异常；2019年9月复查，骨髓淋巴细胞免疫分型显示2.7%的CD5+成熟克隆性B淋巴细胞；患者未觉特殊不适，目前自觉症状良好。例3患者2010年9月予以4个疗程FC方案化疗后，病程未缓解。随后历经多次化疗及临床试验，仍未缓解。2018年3月开始口服伊布替尼治疗，2018年10月因反复发热，停用伊布替尼。骨穿复查，形态显示骨髓增生活跃，淋巴细胞占99%。淋巴瘤免疫分型显示91.9%的CD5+成熟克隆性B淋巴细胞。骨髓活检（大病理）提示符合小B细胞淋巴瘤/淋巴细胞白血病。淋巴结活检显示符合小B细胞淋巴瘤/淋巴细胞白血病。IGHV突变率为9.7%。之后于2019年4月继续口服伊布替尼至今，目前血象正常。

讨 论

超过80%的CLL患者有染色体异常，大多为13q–、+12、11q–、17p–等，而累及14q32/IGH重排的异常则非常少见，仅见于4%的CLL[3]。t（14；18）（q32；q21）核型是其中一种，在分子水平上位于14q32的IGH基因与位于18q21的BCL-2基因并置，导致BCL-2基因过表达，该异常被认为是FL的特征性异常，可见于90%以上的FL，少数见于CLL[4，5]。t（18；22）（q21；q11）被认为是t（14；18）的变异易位，在分子水平上位于22q11的IGL基因和位于18q21的BCL-2基因并置，同样导致BCL-2基因过表达[7]。t（18；22）（q21；q11）异常最早由ADACHI等[8]于1989年首次报道，迄今为止共有32例报道，其中24例为CLL，3例为FL，3例为非特殊类型成熟B淋巴细胞肿瘤，2例为弥漫大B细胞淋巴瘤。这些资料表明，尽管t（14；18）异常大多见于FL，但其变异易位t（18；22）却多见于CLL。尽管如此，t（18；22）（q21；q11）在CLL中总体发生率非常低。DICKER等[6]报道的132例CLL患者中仅1例为t（18；22）（q21；q11），发生率为0.76%。而本中心从2010年1月至今明确诊断为CLL的患者共1 035例，其中t（18；22）（q21；q11）仅3例，发生率约为0.29%，略低于文献报道。根据文献报道[9]，CLL中累及IGH的重排核型常常伴有+12，本组病例中例1所分析异常细胞均为t（18；22）同时伴有+12，例2中3个细胞t（18；22）为唯一异常，例3中5个细胞t（18；22）为唯一异常，2个细胞同时伴有13q–，表明该异常既可以作为唯一异常，又可以和CLL中的其它常见异常伴随出现。

细胞免疫分型是CLL诊断最为重要的指标。一般而言，典型的CLL细胞为CD5+、CD10–，此外还表达其它相关指标，包括CD19、CD20、CD23、CD38、FMC7、κ、λ等。文献报道的23例伴有t（18；22）（q21；q11）的CLL病例中，14例患者具有较为详尽的细胞免疫表型检测结果，均为CD5+、CD10–；7例共表达CD19、CD20、CD23；1例仅表达CD19；2例CD19、CD23共表达；2例仅表达CD20；1例仅表达CD23；1例CD20和CD23共表达。另外，14例病例中，2例表达CD38；4例表达或弱表达FMC7[6，7，10-17]。本文3例CLL患者与文献中报道的伴有t（18；22）（q21；q11）的CLL类似，细胞免疫分型也均为CD5+、CD10–、CD19+、CD20+或±，与其它CLL相比，伴有t（18；22）（q21；q11）的CLL免疫表型无明显改变。

研究发现，与t（14；18）相比，t（18；22）累及2个基因的断裂点也不同。t（14；18）中，BCL-2基因大多为主要（mbr）和次要（mcr）断裂位点，位于BCL-2的3'端（C端）或近端30kb处，而IGH断裂点位于5'端（N端），发生易位后，BCL-2的3'端与IGH的5'端并置；而t（18；22）中，BCL-2的断裂点均位于5'端（N端），又称为变异簇区域（VCR），IGL断裂点位于3'端（C端），易位使得BCL-2的5'端与IGL的3'端并置[18]，使得BCL-2基因过表达，导致恶性肿瘤的发生发展。本文3例患者均由FISH证实累及BCL-2基因的断裂，例1患者进行了全基因组测序，证实t（18；22）易位累及18q21的BCL-2基因，且断裂位点位于该基因的5'UTR区域，而22q11累及IGLL5基因，断裂点位于该基因3'端的内含子，两者发生了并置。有文献报道，t（14；18）的变异易位患者，其BCL-2基因表达量甚至高于t（14；18）者，因无t（14；18）易位患者标本，故未能对3例患者进行BCL-2表达量的验证。

根据文献报道，伴有IGH易位的CLL患者其首次治疗间隔时间（Time to first treatment，TFT）较低危组患者缩短，为预后中等或高危[19]。另有文献认为，CLL中IGH与不同的对手基因易位，预后不同，t（14；18）/BCL-2-IGH易位者预后良好，而其它如t（14；19）/BCL-3-IGH易位者则与高危组CLL患者相似，预后不良[20]。t（18；22）/BCL-2-IGL为t（14；18）的变异易位，伴有该异常的病例是否具有与t（14；18）异常的CLL一样的预后尚未可知。本文中例1和例2患者在初诊时染色体结果均为t（18；22）异常，例3患者初诊核型正常，治疗后复查为t（18；22）异常核型，但也不能排除初诊时的漏检，因无标本，故未能进行BCL-2重排FISH检测。3例患者均在初诊时即被诊断为Rai III期和Binet C期，随即进行了治疗，表明该类患者TFT时间非常短。例1和例3在初诊时即进行了CLL组套FISH检测，例1为唯一+12，例3为唯一13q–，且伴有IGHV突变，2例患者FISH结果均未检测到11q–和17p–等高危因子，根据目前的CLL预后评估体系判断，患者分别为中危和低危组。但例1和例3患者治疗过程中始终未能缓解，例2患者经过短暂的缓解（5个月）后复发，目前3例患者均存活，随访时间分别为26、28、126个月。尽管t（18；22）异常的CLL病例数较少，但从本组病例可以看出，伴有t（18；22）异常的CLL可能具有难治性和易复发等特点。由于例1和例2随访时间较短，t（18；22）异常对生存期是否有影响尚不清楚。

综上所述，t（18；22）（q21；q11）作为t（14；18）（q32；q21）的变异易位，与t（14；18）异常具有不同的分子结构。其发生率非常低，多见于CLL，可能具有难治性和易复发等特点。因病例数太少，需要积累更多病例进行更加深入的研究才能完全阐明伴有该异常的CLL的分子生物学特征。另外，本组病例也表明，对CLL患者进行DSP30+IL-2刺激后再检测染色体非常重要，有可能发现FISH检测结果以外的异常信息。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突