染色体易位携带者的胚胎基因组拷贝数变异分析

李哲涛，李伍高，唐永梅，秦祖兴，唐妮，何萍，唐宁

染色体平衡易位是人群中最常见染色体结构异常，在产前诊断样本及新生儿中携带率分别为0.40%和0.19%[1]，其中包括相互易位和罗氏易位。染色体的平衡易位可以产生平衡和不平衡两种分离方式，平衡的分离方式不会产生异常个体，除非断点处伴随有重要基因的缺失，而不平衡的分离可能导致不孕、复发性流产、子代发育迟缓、智力低下和出生缺陷等[2]。若夫妻双方一方携带有染色体平衡易位，其流产风险会增高，同时活产率也会降低。胚胎植入前染色体结构重排遗传学检测(Preimplantation genetic testing for structural rearrangements，PGT-SR)是一种有效的改善易位携带者生育问题的一种方式，已广泛在临床上应用[3]。本研究通过对PGT-SR结果的分析，进一步探讨染色体平衡易位对胚胎染色体组成的影响因素及分离特点，为易位携带者遗传咨询提供更准确的数据支持和更有效的风险评估。

1 资料和方法

1.1 研究对象

研究纳入柳州市妇幼保健院2018年1月至2019年11月在本中心进行第三代辅助生殖患者，共收集140个PGT-SR周期病例，其中相互易位96个周期，罗氏易位44个周期。夫妻双方均进行了外周血核型分析，且其中一方为染色体易位携带者。该项目通过柳州市妇幼保健院生殖医学伦理委员会批准，所有患者行PGT-SR前签署知情同意书。

1.2 研究方法

1.2.1 囊胚活检 采用常规长方案促排，于取卵后4 h采用卵胞浆内单精子显微注射(Intracytoplasmic sperm injection，ICSI)进行受精，16～18 h后检查受精情况，胚胎培养至囊胚期参考Gardner评级系统进行评估，囊胚选择标准为囊胚分期到达3～5期之间，囊胚内细胞团达到C以上，外滋养层达到C以上，认为是可进行囊胚活检。

1.2.2 PGT-SR检测方法 将囊胚活检的3～5个细胞转移至PCR管中，活检细胞全基因组扩增采用植入前胚胎染色体非整倍体检测试剂盒(贝瑞和康，中国)。胚胎高通量测序检测使用CN500测序平台(Illumina公司，美国)，通过科孕安数据分析系统(贝瑞和康，中国)对测序原始数据进行生物信息学分析，质控要求文库浓度检测浓度不小于10 ng/μL，原始数据质量过滤后的reads数≥2.7 M，质量值Q30的碱基百分比≥80%，分析标准为Uniq reads≥1.5 M，对染色体进行整倍体、微缺失及微重复的判读。

1.2.3 分析指标 根据高通量测序结果，胚胎存在≥10 M的拷贝数异常视为非整倍体胚胎。异常位置发生在易位的染色体处判为亲缘易位的染色体，发生在非易位的染色体处判为非亲缘易位的染色体异常，同时发生在易位和非易位的染色体处则判定为混合型异常。根据相互易位携带者性别、是否有近端着丝粒染色体及染色体断裂点位置的不同，分别分析5种理论分离模式(2∶2对位分离、2∶2邻近-1分离、2∶2邻近-2分离、3∶1分离、4∶0分离或其他 )[4]所占的比例。

1.3 统计学方法

采用SPSS 23.0统计软件进行分析，计数资料采用例(%)表示，行χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料

共纳入染色体相互易位夫妇96个周期，女方平均年龄(31.68±3.96)岁，共培养囊胚637枚，检测成功率为96.70%(616/637)，其中男性携带者57个周期，成功检测350枚囊胚，女性携带者39个周期，成功检测266枚囊胚。罗氏易位夫妇44个周期，女方平均年龄(31.02±3.67)岁，培养囊胚316枚，检测成功率为94.94%(300/316)，其中男性携带者29个周期，成功检测215枚囊胚，女性携带者15个周期，成功检测85枚囊胚。

2.2 PGT-SR胚胎染色体异常情况分析

相互易位携带者胚胎染色体非整倍体率为81.8%(504/616)，显著高于罗氏易位携带者(65.7%,197/300)，差异具有统计学意义(χ2=29.300，P<0.001)。进一步分析携带者性别和女性年龄对胚胎染色体拷贝数异常的影响，发现在相互易位和罗氏易位中，男性携带者整倍体胚胎率均显著高于女性携带者，且差异有统计学意义(P<0.05)，而胚胎非整倍体率在不同女方年龄段中比较，差异无统计学意义，详见表1。

表1 不同易位类型中携带者性别和女方年龄对胚胎非整倍体率的影响[例(%)]

2.3 胚胎异常染色体来源分析

将胚胎异常染色体来源分为3组，分别为亲缘易位的染色体异常(胚胎异常的染色体来自于父方或母方易位染色体)，非亲缘易位的染色体异常(胚胎异常的染色体不来自于父方或母方易位染色体，可能涉及一条或多条染色体异常)和混合型异常(胚胎异常的染色体来自于父方或母方易位染色体同时也发生在非亲缘易位的染色体上)。女方年龄<35岁组的亲缘性易位胚胎高于女方年龄≥35岁组(P<0.05)。相互易位组胚胎发生亲缘易位的染色体异常率显著高于罗氏易位组(χ2=17.082,P<0.001)，而罗氏易位组胚胎中非亲缘易位的染色体异常高于相互易位组，差异有统计学意义(χ2=34.917,P<0.001)。相互易位组与罗氏易位组男性携带者胚胎产生非亲缘易位的染色体异常比例高于女性携带者，差异有统计学意义(P<0.05)。详见表2。

表2 不同女方年龄和携带者性别对胚胎异常染色体来源的影响[例(%)]

非亲缘易位的染色体异常与混合型异常占了很大比例，而这些异常都是新发变异引起的，为进一步分析在相互易位和罗氏易位携带者胚胎中新发变异的类型分布情况，将两组新发异常的染色体分为：单体、三体、片段缺失/重复及嵌合4种情况进行比较。结果显示各新发异常类型在相互易位和罗氏易位组间比较，差异无统计学意义。详见下页表3。

表3 不同指征患者间新发染色体异常类型分布情况[例(%)]

2.4 不同因素下的胚胎染色体分离模式分析

理论上相互易位的异常分离模式可分为：2∶2对位分离、2∶2邻近-1分离、2∶2邻近-2分离、3∶1分离和4∶0分离或其他5种，为探究这些分离模式的影响因素，分别对携带者性别，是否携带近端着丝粒染色体和断裂点位置进行了分组比较。在不同携带者性别下，男方携带染色体易位组产生的配子在5种分离模式下所占的比例分布与女方携带者组比较，差异有统计学意义(P<0.001)。进一步对各类型分离模式进行两两比较，发现男方携带者产生正常/平衡配子的比例显著高于女方携带者(χ2=4.777,P=0.029)，在女方携带者异常配子中，2∶2邻近-2分离与3∶1分离的比例均高于男方携带者，差异有统计学意义(P<0.05)。将易位发生在近端着丝粒染色体的患者纳入近端着丝粒染色体参与组，反之则纳入非近端着丝粒参与组，两组患者配子的分布比较差异有统计学意义(P<0.05)，进一步两两比较分析发现，尽管两组在产生正常/平衡的配子率上比较，差异无统计学意义，但有近端着丝粒染色体参与的分离，配子发生3∶1分离的比例高于非近端着丝粒染色体参与(P=0.001)。以易位的断裂点位置是否在染色体末端分组，分为末端断裂组与非末端断裂组，两组进行对比分析，发现断裂点所在的位置对胚胎整倍体率及分离模式没有影响。详见表4。

表4 不同携带者性别、染色体种类及断裂点位置下的胚胎染色体分离模式[例(%)]

3 讨论

染色体易位携带者临床上所表现的不孕不育、复发性流产、出生缺陷和死胎畸胎的不良妊娠结局等，主要原因是由于染色体不平衡分离，导致胚胎染色体拷贝数异常所造成的[5]。根据孟德尔遗传定律，染色体相互易位携带者异常配子率为16/18，远高于罗氏易位携带者4/6的异常配子率，与本研究的结果一致。对于携带者性别是否影响胚胎染色体分离，既往研究呈现出不一致的结论，Lledó B等[6]人分析了118枚第3天卵裂球结果发现，易位男性携带者与女性携带者产生的配子，正常/平衡的胚胎率差异无统计学意义，而Mateu-Brull E等[7]对易位携带者第3天的胚胎研究中发现女性携带者异常胚胎率更高，在第5天囊胚中染色体不平衡率没有性别差异。本研究在对易位携带者第5天的胚胎分析中显示，无论是在相互易位携带者中还是在罗氏易位携带者中，女性携带者胚胎非整倍体率均高于男性携带者，且差异具有统计学意义，该结论与Zhang S[8]及其团队的研究结果一致。随着女方年龄的增长，胚胎染色体异常比例随之增高[9]。在本研究中，相互易位和罗氏易位的高龄女性(≥35岁)，胚胎非整倍体率略高于<35岁的女性，但差异无统计学意义。同样的结果，在Zhang S[8]和Ko DS[10]等团队的研究中得到了验证。考虑是因为染色体结构重组是影响易位携带者胚胎不平衡状态的主要因素，不同于正常核型下其他因素所导致的染色体拷贝数异常，因此年龄的因素被弱化了。

对染色体间相互作用(inter-chromosomal effect,ICE)的研究一直存在争议[11]，首次提出是在1963年，认为是由于染色体的易位，会影响其他正常染色体的分离从而导致配子染色体非整倍体的产生[12]。在排除女方年龄因素影响之后，我们发现相互易位携带者比罗氏易位携带者更容易产生亲缘易位的染色体异常，而罗氏易位携带者产生非亲缘易位的染色体异常(即新发异常)的配子比例更高，因为从理论上分析，相互易位携带者配子亲缘异常的比例就比罗氏易位高，因此会导致两种易位亲缘和非亲缘异常率存在着一定差异。进一步对携带者性别因素分析，男性易位携带者产生非亲缘易位的染色体异常配子风险高于女性易位携带者，与黄秋香等[13]的研究结果一致。分析差异的原因可能是精子数量庞大，在受精过程中会筛选掉部分亲缘异常携带的精子，同时也有可能会产生一些新发异常的精子与卵子结合，从而导致非亲缘性异常配子率增高，但是否与ICE相关仍需要进一步研究。对异常配子来源的分析发现，非亲缘易位的染色体异常及混合型异常所占的异常比例较高，而这两组异常均是由于新发异常引起的，这些新发异常的类型在相互易位和罗氏易位携带者胚胎中的分布并无差异，可见易位染色体有可能影响其他染色体的分离，但在分离类型上并没有倾向性。

相互易位染色体异常配子分离的模式可以分为2：2对位分离、2∶2邻近-1分离、2∶2邻近-2分离、3：1分离和4∶0分离等，而只有2∶2对位分离的分离方式才能形成正常/平衡的可移植胚胎。本研究基于高通量测序的平台上分析胚胎全基因组的拷贝数情况，有助分析胚胎的分离特点。而实际在分析囊胚期样本时，4∶0分离模式下的产物很少见，在4∶0或其他分离组中，几乎都是一些混乱分离的形式。为了进一步分析减数分裂分离模式的影响因素，分别对携带者性别，是否携带近端着丝粒染色体和断裂点位置进行分析，发现女方易位携带者发生2∶2邻近-2分离和3∶1分离模式明显高于男方携带者，而男方易位携带者配子发生2∶2邻近-1分离的比例略高于女方携带者，但差异无统计学意义，结果与Zhang S等[8]的研究趋势一致。在减数分裂时期，易位的近端着丝粒染色体容易形成不稳定的四射体，Lim CK[14]的研究团队报道了有近端着丝粒染色体参与的相互易位，其产生正常/平衡的配子比例低于非近端着丝粒染色体参与的易位，而本研究两组间差异无统计学意义，但是在3∶1分离模式下，近端着丝粒染色体参与组产生配子的比例要高于非近端着丝粒组，结果与Lim CK等[14]的研究是一致的。同时在对断裂点位置的分析中发现，断裂点位置位于染色体末端的易位携带者，其胚胎正常率与非末端组差异无统计学意义，产生2∶2邻近-2分离的配子比例低于非末端组，但差异无统计学意义，研究结果与Wang J等[15]相似。

本研究通过二代测序平台，分析了染色体平衡易位携带者共916枚囊胚的基因组拷贝数情况。结果表明，胚胎染色体非整倍体的发生率与染色体平衡易位的类型及携带者的性别有关，相互易位携带者胚胎以亲缘易位的染色体异常为主，罗氏易位携带者更容易产生新发的染色体异常，在男方携带中更为明显。易位染色体中是否有近端着丝粒参与和易位断裂点的位置是否在染色体末端影响减数分裂期间配子的分离模式，但与胚胎整倍体的比例不相关。