蘑菇状蛹虫草子实体的诱发及虫草素含量分析*

梁建东 ，陈万浩 ，代永东 ，韩燕峰 ，田维毅 ，梁宗琦

（1．贵州中医药大学基础医学院，贵州 贵阳 550025；2．贵州中医药大学菌物药研究中心，贵州 贵阳 550025；3．贵州大学真菌资源研究所，贵州 贵阳 550025）

蛹虫草 [Cordyceps militaris(L．)Link]与冬虫夏草 [Ophiocordyceps sinensis(Berk．)G．H．Sung,J．M．Sung,Hywel－Jones&Spatafora]、蝉花 （Isaria cicadae Miq．）等相比，野外的种群数量相对较小，不足以提供人们的商品需求。因而，规模化人工培养蛹虫草子实体成为利用这一资源的重要途径。我国是世界上首个利用昆虫蛹规模化培养蛹虫草子实体的国家[1]。自首次规模化人工培养蛹虫草成功以来，人工培养蛹虫草子实体的方法已有较大的进步[2－3]。在人工选育高产、高适应性及高虫草素含量的菌株方面也做了不少研究工作。如通过基因组DNA去甲基化[4]、离子束诱变[5]、蓝光受体CmWC－1介导[6]、复壮退化菌株[7－8]等研究，已获得一些遗传稳定的高产、高虫草素含量的菌株。在培养条件方面，通过控制光照、温度等条件，子实体产量亦可得到提高[9-10]。此外，固态发酵、液态发酵研究表明，传代次数的增加，发酵菌丝体中的虫草素含量有降低趋势，但子实体中虫草素含量较稳定[5]，一般含量为0.1%～0.5%[11]。

作为新食品资源，市场上细柱状或细头状的子实体，口感缺乏脆性及虫草素含量较低的蛹虫草，已不能满足消费者的新需求。选育具有良好商品形态（如蘑菇状或粗壮子实体）及虫草素含量较高的生产菌株已成为亟待解决的学术及生产问题。

以大米和鸡蛋为主要基质，通过不同组合筛选，以期诱发形成蘑菇状形态（或粗壮型）及兼顾虫草素含量较高的菌株。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株

蛹虫草菌株C.militaris（编号PM-LNQS），分离自辽宁千山采集的蛹虫草新鲜标本，保存于贵州大学真菌资源研究所。

1.1.2 试剂

虫草素对照品购自美国Sigma公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.1.3 仪器

分析型高效液相色谱，美国安捷伦1100系列；电子天平JA2003，上海天平仪器厂；超声波清洗机SB2200型，必能信超声（上海）有限公司；其他为一般常规仪器。

1.1.4 培养基

菌种活化为常规PDA培养基。蛹虫草液体母种培养基：蛋白胨2%、蔗糖2%、MgSO4·7H2O 0.05%、KH2PO40.1%，水1000mL，pH自然，121℃灭菌30min。

固体栽培培养基：全蛋培养基（CE） 为全鸡蛋（去壳）90 g；米饭全蛋培养基（RE）为预先蒸好的米饭45 g、全鸡蛋（去壳） 45 g；蛋黄培养基（CY） 为蛋黄90 g；米饭蛋黄培养基（RY）为预先蒸好的米饭45 g、蛋黄45 g；米饭培养基（CR）为预先蒸好的米饭90 g。以上培养基pH自然，121℃灭菌30 min。

1.2 方法

1.2.1 供试菌株活化

将所试菌株转接于PDA斜面培养基上，25℃培养7 d后备用。

1.2.2 种子液的制备

将接有蛹虫草菌株的PDA斜面培养基在无菌条件下用0.02%吐温80灭菌水洗孢子，孢子液稀释至1×106个/mL后，接种2 mL孢子悬液到液体母种培养基中（250 mL三角瓶装液量为 50 mL），在25℃、150 r·min-1条件下，震荡培养4 d，备用。

1.2.3 接种及培养

取5 mL液体发酵所得的悬液（菌丝段浓度为1×106个/mL），接种于灭菌的不同固体栽培培养基上，每种培养基接种5瓶，放入人工气候箱恒温25℃暗培养，待菌丝长满整个培养基时改为变温见光培养（白天12 h见光培养，光照强度为400 lx～600 lx，温度为22℃；晚上暗培养12 h，温度为15℃）。每日观察记录，培养75 d后采收，测量，取样。

1.2.4 虫草素和相关核苷类物质含量测定

将子实体和培养基分别采收，称重后于42℃烘干至恒重，粉碎机粉碎，过60目筛。称取干菌粉0.1 g置于具塞试管中，加入双蒸水10 mL，超声处理30 min，经0.45 μm滤膜过滤[12]。

色谱柱为Thermo Scientific Hypersil ODS-2(C18)（150 mm× 4.6 mm，5 μm)；流动相为 10 mmol·L-1KH2PO4（溶于甲醇） ∶双蒸水为 8∶92；检测波长254 nm；柱温45℃；流速为1.0 mL·min-1；进样量20 μL。

1.2.5 数据统计与分析

取样测定虫草素和相关核苷类物质含量，以平均值±标准偏差（n=3） 表示。采用SPSS 16.0软件进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 不同培养基对子实体形态与特性的影响

2.1.1 不同培养基对子实体形态的影响

菌株在不同固体培养基中的培养结果见图1。

由图1所示，在发菌阶段，观察到全部固态培养基中的纯白色菌丝体生长旺盛，并在7 d～10 d内覆盖整个培养基；随后全蛋培养基、米饭全蛋培养基和蛋黄培养基表面的菌丝开始变为橙色，子实体开始生长。在原基和子实体生长阶段，全蛋培养基原基出现最晚，子实体生长最快、粗壮、顶部有明显膨大和出现蘑菇状的子实体，蘑菇状子实体顶部有明显的瘤状突起。米饭全蛋培养基最早出现原基，后可见橙色幼嫩子实体沿瓶壁生长，逐渐变金黄色指状子实体，继续发育产生子囊头。蛋黄培养基子实体生长最慢，发育良好，不光滑、分枝多，大部分子实体纤细，未形成子囊头。米饭蛋黄培养基、米饭培养基菌丝未见明显转色，未有子实体长出。

图1 在不同固体培养基上的子实体形态Fig．1 Themorphologyofthefruitingbodiesondifferentsolidmedium

2．1．2 不同培养基对原基形成时间、子实体重量和生长速率的影响

将长出子实体的培养基各取3瓶，称其鲜重；烘干，再称其干重，计算每瓶子实体的鲜重均值、干重均值和鲜重与干重比值结果见表1。

由表1可知，当培养基为全蛋培养基（CE） 时子实体原基出现最迟，但生长最快，子实体鲜重也最大，为26．34 g。随着培养基组分的变化，加入大米（RE培养基） 或采用全蛋黄（CY培养基） 时，子实体鲜重随之减少，分别为 22．86 g、12．49 g。不同培养基对蛹虫草子实体干重、个数影响趋势与鲜重相同，并且蛋黄培养基的鲜重与干重比值较高。

表1 不同固体培养基上子实体的培养性状统计Tab．1 Cultural characteristics statistics of fruiting bodies on different solid medium

2.2 不同培养基对虫草素、腺苷、腺嘌呤含量的影响

2．2．1 不同培养基对虫草素含量的影响

不同培养基对子实体和培养基中虫草素含量的影响见图2。

由图2可知，蛋黄培养基中子实体的虫草素含量最高，为 30 414 μg·g－1，在蛋黄培养基 （CY） 中加入大米后，会抑制子实体的形成且基质中虫草素含量较低。而未形成子实体的米饭培养基中虫草素含量最高。

图2 不同固态培养基对子实体和基质中虫草素含量的影响Fig．2 Effects of different solid medium on cordycepin content in fruiting bodies and substrates

2．2．2 不同培养基对腺苷含量的影响

腺苷是虫草素合成的前体物质[13]，直接促进虫草素的生物合成，其含量将直接影响基质中虫草素的含量。不同培养基对子实体和基质中腺苷含量的影响见图3。

图3 不同固态发酵培养基对子实体和基质中腺苷含量的影响Fig.3 Effects of different solid medium on adenosine content in fruiting bodies and substrates

由图3可知，培养基中加入一定量的大米均不利于子实体中腺苷的积累，且相比于大米培养基（CR），加入全蛋（RE培养基）或蛋黄（RY培养基），腺苷含量均有所提高。该研究结果与简利茹等[14]添加鸡蛋对腺苷的生产具有缓慢促进作用基本吻合。5个培养基质中腺苷含量差异明显，以全蛋培养基最佳，达到458.40 μg·g-1，且子实体中腺苷含量亦最高，达到 799.10 μg·g-1。

2.2.3 不同培养基对腺嘌呤含量的影响

腺嘌呤是腺苷的前体，间接参与虫草素生物合成[13]，适量地添加腺嘌呤能显著提高基质中虫草素的产量和生产效率[15]，因而检测腺嘌呤的含量可以反应培养基合成虫草素的潜在能力。不同培养基对子实体和基质中腺嘌呤含量的影响见图4。

由图4可知，不含大米的全蛋培养基、蛋黄培养基比含大米的米饭全蛋培养基、米饭蛋黄培养基中的腺嘌呤含量更高。从子实体及所有基质中的腺嘌呤含量看，蛋黄培养基中的子实体含量最高，达到70.85 μg·g-1。在含大米培养基中，添加全蛋（RE培养基）时腺嘌呤的含量减少，而添加蛋黄（RY培养基）时腺嘌呤含量提高。

图4 不同固态发酵培养基对子实体和基质中腺嘌呤含量的影响Fig.4 Effects of different solid medium on the content of adenine in fruiting bodies and substrates

3 结论与讨论

随着蛹虫草的功能逐步被认可，优质高产子实体的培养技术越来越受关注[16]，在蛹虫草人工培养中，菌种制备、培养基和培养条件的选择是关键。液体菌种是规模化生产中的首选菌种，其具有制备时间短、污染率低、菌种质量较高等优点。种子液的菌丝段浓度会直接影响培养能否成功。研究采用浓度为1×106个/mL的孢子悬液，接种至2 mL到50 mL培养基中，25℃、150 r·min-1震荡培养4 d时，菌丝球的大小、数量及种子液的浓度处于最佳状态，接种固体培养基后获得理想效果。

在我国蛹虫草人工培养的早期，已有学者用鸡蛋培养蛹虫草子实体，但长出的子实体基本是纤细的柱状。李辉平和宋金[17]通过对子囊孢子萌发菌株筛选，得到一株膨大矮化的蛹虫草菌株，子座直径达到8.3 mm。本研究获得的子实体整体呈蘑菇状，这与其结果明显不同。现有研究已表明，真菌个体发育的阶段转化及形态建成受多基因调控，培养基中丰富的氮源有利于营养生长和代谢积累，进而也就影响了其向生殖生长的转化[18-20]。所筛选出的含鸡蛋培养基配方实际上促进了营养生长阶段，而抑制了向有性生殖阶段的转化和组织建成，蘑菇状的子实体实为一个营养体。因此，试验为探索培育蘑菇状商品形态的蛹虫草菌提供了新思路。

虫草素是蛹虫草中特有的活性成分，主要存在于子实体中，是反映子实体品质高低的关键成分。从微生物代谢角度可知，虫草素合成的直接前体物是腺苷，腺嘌呤、次黄嘌呤等间接参与虫草素合成[16，21]，故本试验综合考察虫草素、腺苷、腺嘌呤的含量以筛选出高品质子实体培养基。全蛋培养基子实体形态差异较大，原基分化最迟，但个数最多，生长速率最快，颜色较黄、略暗，腺苷含量最高。蛋黄培养基子实体的外观性状最好，但个数最少，生长速率最慢，色泽呈鲜亮的桔黄色，虫草素和腺嘌呤含量最高。米饭培养基未形成子实体，但其培养基质中含虫草素最多，而其他形成子实体的培养基中也有虫草素积累，且含量高低与子实体中含量的变化并不一致，这说明基质中菌丝产虫草素的能力较强，且与子实体形成的关系不大。另外，根据研究结果，虫草素、腺嘌呤、腺苷的含量与蛹虫草子实体长势情况并不直接相关，单从子实体的形态特性来判断蛹虫草生长最适培养基具一定的局限性。虽然部分培养基不能出现转色出菇，但仍能测出一定量的腺苷、腺嘌呤及虫草素，可作为提取虫草素的原料，为以后开发不出菇的蛹虫草固体培养基提供了可参考的线索。