不同培养温度及孢子稀释液对黑牛肝菌孢子萌发的影响*

罗顺珍，陈 燕，曹 旸，纪光燕，陶 玲，晏汐蓓，纪开萍

（景洪宏臻农业科技有限公司，云南 景洪 666100）

黑牛肝菌 [Phlebopus portentosus(Berk．&Broomo)Boedijn]，又名暗褐网柄牛肝菌，隶属于担子菌门（Basidiomycota） 伞菌纲（Agaricomycetes） 牛肝菌目（Boletales） 小牛肝菌科（Boletinellaceae） 脉柄牛肝菌属（Phlebopus），分布于斯里兰卡、越南、印度尼西亚、泰国、巴西、墨西哥、澳大利亚、新西兰等国家，国内广西、海南、云南等省均有分布[1－7]，其子实体味道鲜美，营养丰富，具有很高的经济价值。

目前，黑牛肝菌已实现了工厂化周年栽培[8]。在食用菌栽培产业中，需要不断选育新的品种，以提高生产效率，增加商品价值和降低菌种退化风险。与其他有漫长栽培历史的食用菌种类相比，黑牛肝菌工厂化栽培作为新兴产业，其需求更加明显。在食用菌品种选育中，杂交育种是使用最广泛，收效最显著的手段之一，其原理是通过单单杂交、双单杂交或多孢杂交等方法实现基因重组，并从其后代中筛选优良菌株[9]。因此，通过有性孢子萌发获得单倍体菌丝，是许多食用菌杂交育种工作的前提。因此，通过调整培养温度，浸泡时间，以及孢子稀释液的pH、添加碳源、氮源等条件，对黑牛肝菌的担孢子萌发特性进行了探索，为其杂交育种工作奠定基础，具有较强的理论应用价值。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试黑牛肝菌担孢子采自工厂化栽培菇房所生产的成熟子实体，菌株编号HZ14080。

1.2 培养基及仪器用具

培养基为M1固体培养基[10]。试验仪器包括LS-75HD型灭菌锅，江阴滨江医疗设备有限公司；SWCJ-1F型超净工作台，苏净集团苏州安泰空气技术有限公司；FE20型pH计，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；FYL-YS-403L型恒温培养箱，北京福意电器有限公司。

1.3 黑牛肝菌担孢子的收集

在工厂化栽培菇房中预留黑牛肝菌子实体，即将成熟时采收。以无菌水冲洗子实体后，用75%酒精对其进行表面消毒，并用解剖刀去除菌柄。菌盖于室温下置于灭菌滤纸片上，室温下放置12 h～24 h后即形成孢子印，随即将该滤纸片剪成条状放入灭菌试管备用。

1.4 不同培养温度对孢子萌发的影响

用血球计数板进行计数，以无菌水将孢子稀释至浓度3×104个/mL。将制好的孢子悬浮液充分震荡后，取200 μL，在M1固体培养基上涂布后分别置于15℃、20℃、25℃、30℃、35℃培养箱中培养50 d，每个处理6个重复。

1.5 浸泡时间对孢子萌发的影响

以无菌水将孢子稀释至浓度3×104个/mL，并分别在室温下取200 μL直接涂布M1固体培养基（未浸泡）、放置12 h、24 h、36 h、48 h、60 h，取200 μL涂布于M1固体培养基，30℃培养50 d，每个处理6个重复。

1.6 孢子稀释液pH对孢子萌发的影响

以1 mol·L-1的HCl或NaOH制备pH分别为4、5、6、7、8、9的无菌水，以未调pH的无菌水作为空白对照（CK），稀释黑牛肝菌担孢子至浓度3×104个/mL。取200 μL涂布于M1固体培养基，30℃培养50 d，每个处理6个重复。

1.7 不同碳源稀释液对孢子萌发的影响

分别配置1%的蔗糖、果糖、淀粉、乳糖以及葡萄糖溶液，灭菌后用于稀释孢子，以无菌水作为空白对照（CK），稀释至浓度3×104个/mL后，取200 μL涂布于M1固体培养基，30℃培养50 d，每个处理6个重复。

1.8 不同氮源稀释液对孢子萌发的影响

分别配置0.1%的酵母浸膏、蛋白胨、酒石酸铵、牛肉浸膏以及尿素溶液，灭菌后用于稀释孢子，以无菌水作为空白对照（CK），稀释至浓度3×104个/mL后，取200 μL涂布于M1固体培养基，30℃培养50 d，每个处理6个重复。

1.9 数据分析

由于黑牛肝菌的孢子萌发试验未见文献报道，多次试验发现黑牛肝菌孢子萌发率极低，而将萌发形成的菌落数目作为统计分析对象。因此，对以上试验每个重复中萌发的菌落数目进行统计，并利用DPS V7.05软件，以单因素方差分析比较不同处理间的差异显著性。

2 结果与分析

黑牛肝菌孢子萌发形成的菌落形态见图1。

图1 黑牛肝菌孢子萌发形成的菌落形态Fig.1 Colony morphology of Phlebopus portentosus spore germination

由图1所示，黑牛肝菌孢子萌发的菌落形态之间具有一定的形态差异，这属于黑牛肝菌孢子的遗传物质所决定。同一黑牛肝菌子实体收集的孢子印中孢子在不同的处理条件下黑牛肝菌孢子萌发的菌落形态无较大差别。

2.1 不同培养温度对孢子萌发的影响

不同培养温度对孢子萌发的影响见表1。

如表1所示，黑牛肝菌孢子在15℃～35℃均能萌发，在30℃下的平均萌发数显著高于15℃及20℃下的平均萌发菌落数，30℃下培养也具有最高的中位数，说明温度对黑牛肝菌的孢子萌发有一定的影响，30℃为最适温度。

表1 不同培养温度下的萌发菌落数Tab.1 Germination numbers of Phlebopus portentosus spores under different culture temperature

2.2 浸泡时间对孢子萌发的影响

浸泡时间对黑牛肝菌孢子萌发的影响见表2。

表2 不同浸泡时间后的萌发菌落数Tab.2 Germination numbers of Phlebopus portentosus spores with different soaking times

由表2可知，在进行涂布培养之前，对黑牛肝菌孢子进行浸泡会对其萌发产生一定的影响。其中，浸泡24 h的萌发菌落数与其他浸泡时间相比有显著差异，中位数也是其他试验的两倍以上。随着浸泡时间的延长，萌发菌落数有所下降。浸泡60 h后，孢子不能萌发。

2.3 孢子稀释液pH对孢子萌发的影响

孢子稀释液pH对孢子萌发的影响见表3。

由表3可知，对孢子稀释液设置了6个不同的pH梯度，培养后发现pH为6的孢子稀释液萌发数最高，与其他pH稀释液相比差异具有显著性，但与未调pH的无菌水对照之间差异不显著。pH为4、8和9时，萌发数显著低于对照，说明对孢子萌发产生了抑制作用。

表3 不同pH稀释液中的萌发菌落数Tab.3 Germination numbers of Phlebopus portentosus spores with dilutions of different pH

2.4 不同碳源稀释液对孢子萌发的影响

不同碳源稀释液对孢子萌发的影响见表4。

表4 不同碳源稀释液中的萌发菌落数Tab.4 Germination numbers of Phlebopus portentosus spores with dilutions of different carbon sources

由表4可知，以1%的葡萄糖溶液稀释黑牛肝菌孢子，得到了较高的萌发菌落数。与同浓度的淀粉、果糖和乳糖溶液相比，差异具有显著性。与添加蔗糖和CK相比，差异不显著。

2.5 不同氮源稀释液对孢子萌发的影响

不同氮源稀释液对孢子萌发的影响见表5。

由表5可知，在稀释液中添加0.1%的不同氮源后发现，添加酒石酸铵和尿素后，萌发菌落数目显著高于添加蛋白胨，酵母浸膏和CK处理，与添加牛肉浸膏的处理无显著差别。

表5 不同氮源稀释液中的萌发菌落数Tab.5 Germination of Phlebopus portentosus spores with dilutions of different nitrogen sources

3 讨论

孢子萌发是食用菌育种工作的重要环节。由试验结果可知，黑牛肝菌的担孢子萌发相对困难。在前期的研究工作中，其孢子萌发所需的培养时间较长，从培养后10 d开始有零星的萌发菌落出现，至培养后50 d，其间不断会有新的萌发菌落出现，因此将统计萌发菌落的培养时间设为50 d。

另一方面，黑牛肝菌的孢子萌发率也较低，按本研究中萌发菌落数目最高的处理计算，也约为0.1%，这与其他栽培食用菌相比差距较大。如草菇（Volvariella volvacea） 的孢子萌发率在培养48 h后可达30%以上[11]，香菇（Leotinula edodes） 孢子培养10 d后可达60%以上[12]，贮藏4个月的金针菇（Flammulina velutipes） 担孢子培养24 h后，其萌发率甚至能达到100%[13]。相反，还不能进行人工栽培的外生菌根菌，如兰茂牛肝菌（Lanmaoa asiatica），在培养7 d后也仅有“极少量”的孢子开始萌发[14]，与本研究中的黑牛肝菌较相似。造成这种差别的原因可能是担孢子萌发率高的食用菌主要为腐生菌，在人工合成的培养基上能够快速生长，而作为外生菌根菌的兰茂牛肝菌，利用人工培养基的能力相对较弱，也就影响了孢子萌发率。黑牛肝菌是否是外生菌根菌，目前还存在争议，但可以肯定的是，其腐生能力远低于一般的腐生食用菌[15-17]，这可能也是其孢子萌发较困难的原因。

在本研究中，尝试通过调整培养温度、浸泡时间、孢子稀释液pH，以及添加碳源、氮源等条件，提高黑牛肝菌担孢子萌发率，发现30℃下培养、涂布前浸泡24 h、调节孢子稀释液pH至6、在稀释液中添加1%葡萄糖、0.1%酒石酸铵或尿素，均能在一定程度上提高黑牛肝菌的担孢子萌发菌落数。在今后的工作中，还将继续对黑牛肝菌的孢子萌发进行研究，包括不同菌株间萌发能力的差别、萌发培养基改良、萌发前预处理等，希望能大幅度提高黑牛肝菌孢子萌发能力，为杂交育种工作提供更多更丰富的种质材料。