草菇自溶过程中果胶酶及纤维素酶的活力变化*

刘静华，欧阳钰，钟舒雅，马钰霖，陈诗依，吴 偲，刘 主

（韶关学院英东生物与农业学院，广东 韶关 512005）

草菇（Volvariella volvacea），担子菌亚门（Basidiomycatina） 层菌纲 （Hyoenomycetes） 伞菌目（Agaricales） 光柄菇科 （Pluteaceae） 草菇属（Volvariella）[1]。因在稻草上生长得名，又名秆菇、兰花菇、南华菇、中国蘑菇、美味包脚菇等。草菇具有较高的营养成分与保健价值。草菇含8种人体必需氨基酸，占其氨基酸总量的38．2%。草菇含有多糖类物质，能抑制癌细胞生长[2]。同时草菇属于低升糖指数食物，是糖尿病患的理想食物。草菇属于高温型腐生真菌，在10℃～44℃、相对湿度80%～95%时生长旺盛[3]。最适保存温度为15℃，高于或低于15℃均容易发生软化自溶[4]。草菇自溶可能是由于细胞壁结构改变、细胞壁成分降解所致。草菇的细胞壁含有果胶和纤维素等的物质，认为与草菇自溶有关[5]。通过测定不同温度下草菇自溶过程中果胶酶和纤维素酶的活性变化，以期探讨草菇自溶与这两种酶活性的变化关系，以期为草菇保鲜提供参考。

1 草菇细胞壁成分影响酶

1.1 果胶酶

果胶主要是由D－半乳糖醛酸以α－1,4糖苷键连接而成的直链聚合物[6]。果胶酶（pectinase） 是指能够催化果胶质分解的多种酶的总称[7]。果胶酶一般包含果胶酯酶 （pectinesterase）、聚半乳糖醛酸酶（polygalacturonase）、果胶裂解酶 （pectate lyase） 3种。酯酶水解果胶酯成为果胶酸和甲醇；解聚酶分为果胶水解酶和果胶裂解酶，可断开果胶中部分D-半乳糖醛酸的α-1，4糖苷键[8-10]；真菌分解果胶类物质的酶主要是果胶裂解酶。果胶酶瓦解细胞壁中的果胶成分，破坏细胞壁，导致果实软化腐败。故果胶酶与草菇自溶理论上存在一定的关系[11]。

1.2 纤维素酶

纤维素酶（cellulase）是一种多组分复合酶，包含C1酶、Cx酶和β-葡萄糖苷酶3种。其中C1酶可水解天然纤维素成为无定形纤维素，Cx酶可将其继续水解为纤维寡糖，β-葡萄糖苷酶进一步水解纤维寡糖成为葡萄糖。研究认为，纤维素酶在某些水果如青梅[12]、桃[13]、甜樱桃[14]果实的软化中起主要作用。近年来对纤维素酶的研究显示，纤维素酶与果实早期的成熟软化有着密切联系[15]，薛炳烨等[16]发现纤维素酶活性的升高是肥城桃果实硬度下降的首因。Tonutti等[17]报道，桃的果实在呼吸跃变前只有pI6.5的纤维素酶同工酶表现活性，呼吸跃变后出现了pI6.5和pI9.5共2种纤维素酶同工酶。部分真菌的细胞壁含有纤维素[18]，纤维素酶能分解细胞壁中的纤维素，从而使细胞壁遭到破坏。因此纤维素酶也可能与草菇的自溶有关。

2 试验材料和方法

2.1 试验材料

草菇菌株V23，实验室保存；D-半乳糖醛酸，北京金泰宏达生物科技有限公司；葡萄糖，天津市科密欧化学试剂有限公司；醋酸钠缓冲液（0.2 mol·L-1，pH 4.8），西陇化工有限公司；0.25%果胶溶液，浙江一诺生物科技有限公司；二硝基水杨酸试剂（DNS试剂），天津福辰；羧甲基纤维素钠溶液（CMC-Na溶液），天津市大茂化学试剂厂；Ultrospec 2000紫外分光光度计，Pharmacia Biotech；HH-S28s恒温水浴锅，金坛市环保仪器厂；冰箱，华凌；恒温培养箱，广东省医疗器械厂。

2.2 试验方法

2.2.1 草菇粗酶液制备

选取新鲜无损伤、无褐变的草菇子实体1 000 g，无菌水洗净擦干，分为2组，每组各500 g，分别放置于4℃、30℃保存。4℃条件下，每隔2 d观察草菇的自溶情况，加双蒸水提取20 g草菇的液汁为粗酶液进行各项检测，共观察采样8次；由于高温条件下，草菇自溶较快，30℃保存的草菇每隔1 d观察其自溶情况，加双蒸水提取20 g草菇液汁作为粗酶液进行各项检测，共观察采样8次。

2.2.2 果胶酶的活力测定

果胶酶酶活力测定常用方法包括还原法、粘度法、还原糖法（DNS法） 等[16-17]。选用更精确的DNS法测定草菇果胶酶酶活力。3,5-二硝基水杨酸（DNS）与醛糖共热能够产生棕红色的氨基化合物，在一定范围内还原糖量与呈色物溶液颜色成正比，以标准半乳糖醛酸液作标准曲线，540 nm波长下测定待测液吸光值可算出半乳糖醛酸含量，从而计算果胶酶酶活力。

1）半乳糖醛酸标准曲线的绘制

准确称取100 mg分析纯半乳糖醛酸，用pH 4.8醋酸钠缓冲液配制成浓度为l mg·mL-1的半乳糖醛酸标准溶液。取7支刻度具塞试管，分别加入0、0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL 半乳糖醛酸标准液，加入1.5 mL DNS液混合均匀，在沸水浴中加热5 min，取出后立即用流水冷却至室温，每管加蒸馏水稀释到12.5 mL，摇匀，于540 nm波长处测定吸光值。以半乳糖醛酸浓度为横坐标，以光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线。

2）DNS法测定果胶酶酶活力

取2支试管，各加入0.90 mL的0.25%果胶底物溶液（醋酸钠缓冲液配置），置于恒温水浴箱37℃保温5 min。其中1号管（空白管） 加0.20 mL煮沸失活的粗酶液，2号管（样品管） 加入粗酶液0.20 mL，将2支试管置于恒温水浴箱37℃温浴30 min；向各管加入DNS试剂1.50 mL混合均匀，终止反应；沸水浴5 min；流水冷却试管；向试管分别加入双蒸水7.40 mL，混匀；540 nm波长下，以空白管调零，测样品管吸光度，通过半乳糖醛酸标准曲线或用线性回归方程求出还原糖的含量，酶活力（X1，U·mL-1）的计算公式为：

式中：G1为半乳糖醛酸含量（mg）；30为保温时间，即酶与底物作用时间（min）；Ew为粗酶液的体积（mL）。

一个酶活力单位指在37℃、pH 4.8的条件下，每分钟催化果胶水解成1 μmoL半乳糖醛酸的酶量。

2.2.3 纤维素酶酶活力测定

1）葡萄糖标准曲线的绘制

准确称取100 mg分析纯无水葡萄糖（预先在105℃干燥至恒重），用蒸馏水，配制成浓度为 1 mg·mL-1的葡萄糖标准溶液。取7支刻度具塞试管，分别加入0、0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL葡萄糖标准液，加入1.5 mL DNS液（3，5-二硝基水杨酸试剂）混合均匀，在沸水浴中加热5 min，取出后立即用流水冷却至室温，每管加蒸馏水稀释到12.5 mL，摇匀，于520 nm波长处测定吸光值。以葡萄糖浓度为横坐标，以光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线。

2）滤纸法（FPA） 测定纤维素酶酶活力

滤纸含有聚合度、结晶度适中的纤维素，可以定性滤纸为底物，经纤维素酶水解后生成还原糖，以还原糖的量来对标纤维素酶系总的糖化能力。即为滤纸酶活（FPA），此法应用广泛，且能够反映3类酶组分的协同作用[19]。取2支刻度具塞试管，1号为空白管，2号为样品管。分别向2支管中加入0.05 mol·L-1醋酸钠缓冲溶液 （pH 4.8） 2.00 mL，空白管则加入煮沸失活后的纤维素粗酶液1.00 mL，样品管中加入粗酶液1.00 mL，均使管内溶液浸没滤纸（3 cm×2 cm，揉成团），盖塞。将2支试管同时置于50℃水浴锅中水浴60 min。取出后立即加入DNS试剂3.00 mL，摇匀。将2支管同时放入沸水浴中水浴10 min，取出迅速冷却至室温，每管内容物用重蒸水稀释到25.00 mL，摇匀。520 nm波长下，以空白管调零，测样品管吸光度，通过葡萄糖标准曲线或用线性回归方程求出还原糖的含量，酶活力（X2，U·mL-1）的计算公式为：

式中：G2为葡萄糖含量（mg）；60为保温时间，即酶与底物作用时间（min）；Ew为粗酶液的体积（mL）。

一个酶活力单位指在50℃、pH 4.8的条件下，每分钟催化纤维素水解成1 μmol葡萄糖的酶量。

3） 羧甲基纤维素钠（CMC-Na） 法测定纤维素酶酶活力

纤维素酶能降解CMC-Na生成葡萄糖等还原糖，再用DNS法显色，用标准葡糖糖液作标准曲线，520 nm处测其吸光度[20]。取2支刻度具塞试管，1号为空白管，2号为样品管。分别向2管中加入CMC-Na溶液1.00 mL，空白管中加入煮沸失活后的纤维素粗酶液0.50 mL，样品管中加入粗酶液0.50 mL，混匀，盖塞。将2支试管同时置于50℃水浴锅中水浴30 min。取出后迅速加入DNS试剂1.50 mL，摇匀。将试管同时放入沸水中水浴10 min，取出迅速冷却至室温，每管用重蒸水稀释到12.50 mL，摇匀。520 nm波长下，以空白管调零，测样品管吸光度，通过葡萄糖标准曲线或用线性回归方程求出还原糖的含量，酶活力（X3，U·mL-1）的计算公式为：

式中：G3为葡萄糖含量（mg）；30为保温时间，即酶与底物作用时间（min）；Ew为粗酶液的体积（mL）。

一个酶活力单位指在50℃、pH 4.8的条件下，每分钟催化纤维素水解成1 μmol葡萄糖的酶量。

3 结果与分析

3.1 草菇高温自溶对比

草菇自溶前后的对比见图1。

图1 草菇自溶前后对比图Fig.1 Volvariella volvacea before and after autolysis

由图1所示，草菇自溶的过程中，外观色泽逐渐变褐色，气味从鲜菇味变为有刺鼻异味，菇体从硬实有弹性变为软塌，表面出现粘液、出水，为草菇自溶过程发生软化，液化现象。

3.2 半乳糖醛酸标准曲线

半乳糖醛酸标准曲线见图2。

由图2可知，利用Excel 2010绘制标准曲线，得到回归方程及相关系数；对测得的结果进行F检验，F值为0.056 0，P值为0.009 1（P<0.01），差异极显著。R接近于1，说明其相关性较大。

图2 半乳糖醛酸标准曲线Fig.2 Standard curve of galacturonic acid

3.3 葡萄糖标准曲线

葡萄糖标准曲线见图3。

图3 葡萄糖标准曲线Fig.3 Standard curve of glucose

由图3所示，利用Excel 2010绘制标准曲线，得到回归方程及相关系数；对测得的结果进行F检验，F值为0.415 3，P值为0.006 9（P<0.01），差异极显著。R接近于1，说明其相关性较大。

3.4 低温自溶结果

草菇4℃储存条件下果胶酶活力变化曲线见图4。

图4 4℃条件下果胶酶活力变化曲线Fig.4 Variation curve of pectinase activity at 4℃

由图4可知，随着冷藏时间的增加，果胶酶活力在草菇自溶前期趋于不变，但在自溶第12天时突然上升之后又下降；说明低温条件下，果胶酶在草菇自溶后期会产生有一定的影响。不同方法测定4℃储存条件下纤维酶的活力变化曲线见图5、图6。

图5 4℃条件下CMC-Na法测定纤维酶的活力变化曲线Fig.5 Variation curve of cellulase activity by CMC-Na at 4℃

由图5、图6可知在草菇自溶前期，纤维素酶活性先上升后下降，后又趋于稳定。说明低温条件下，纤维素酶影响草菇的自溶前期。由于FPA法能反映纤维素酶中3类酶组分的协同作用，而CMCNa法反映的是内切葡聚糖酶的作用，所以从第6天、第8天、第10天的数据看，2种方法测得的酶活变化趋势略有不同。

图6 4℃条件下FPA法测定纤维素酶的活力变化曲线Fig.6 Variation curve of cellulase activity by FPA at 4℃

综上，草菇在4℃低温自溶过程中果胶酶与纤维素酶对草菇自溶都有一定的影响，但作用的时期不同。

3.5 高温自溶数据表

草菇30℃储存条件下果胶酶活力变化曲线见图7。

由图7所示，30℃处理条件下果胶酶在自溶第1天时，活力达到最大值，之后果胶酶活力随着时间的增加，活力逐渐下降，后期变化趋于平稳。不同方法测定4℃储存条件下纤维酶的活力变化曲线见图8、图9。

图7 30℃条件下果胶酶活力变化曲线Fig.7 Variation curve of pectinase activity at 30℃

由图8、图9可知，在草菇高温自溶过程中纤维素酶活性均为先升高后降低，之后趋于稳定，且在自溶第2天和自溶第3天时，纤维素酶的活力相近，达到最大值，说明纤维素酶在草菇自溶中期有重要影响。

图8 30℃条件下CMC-Na法测定纤维酶的活力变化曲线Fig.8 Variation curve of cellulase activity by CMC-Na at 30℃

图9 30℃条件下FPA法测定纤维素酶的活力变化曲线Fig.9 Variation curve of cellulase activity at 30℃by FPA

4 结论

对比2组试验结果，草菇中果胶酶活性在低温自溶和高温自溶中变化趋势不同。而草菇纤维素酶在低温及高温自溶中的变化趋势相近。

草菇采后即切断了外部环境营养物质的供应，只能通过消耗自身糖类物质产能进行代谢活动[21]。此时菇体内的水解酶如果胶酶、纤维素酶作用于细胞壁、细胞质中的果胶和纤维素，使自身降解、软化、液化，甚至腐烂。试验表明，不管是低温自溶还是高温自溶，草菇内纤维素酶与果胶酶的活力变化对其自溶均有一定的影响；且作用的时期和机制不同。果胶酶在草菇低温自溶后期起主要作用；在高温自溶前期起主要作用。而纤维素酶在草菇低温及高温自溶的前中期起主要作用。表明草菇软化和自溶可能与果胶酶和纤维素酶的活性变化有关，且低温自溶和高温自溶的机制可能不同。对茶树菇（Agrocybe aegerita）[22]、双孢蘑菇 （Agaricus bisporus）[23]自溶机理与真空预冷技术的研究中，也提出在不同贮藏温度下茶树菇、双孢菇内果胶含量和果胶酶、纤维素含量和纤维素酶均有明显差异。