以白酒糟为基质进行酵母培养物的研究

■张 轩

(武汉设计工程学院，湖北武汉 430205)

酵母培养物作为一种微生态制剂，是由酵母菌，主要是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)[1]，在现代发酵工艺控制下采用液、固态相结合或直接在固体培养基上发酵后连同固体基质一起加工制得的产品，其主要成分是酵母发酵固体基质产生的细胞外代谢产物、发酵后变性的固体基质、酵母细胞内容物以及酵母细胞壁[2]。酵母培养物含矿物质、B族维生素、增味物质、消化酶、甘露寡糖、β-葡聚糖和氨基酸以及“未知促生长因子”等，这些物质对于动物胃肠道中的微生物而言是绝好的营养底物，可以激发它们的代谢活性和稳定体内微生态环境[2]，进而提高动物的生产性能。酵母培养物具有绿色天然、无毒副作用以及适口性好、营养丰富等优点[3]，是集保健和营养等多重功效为一体的微生态饲料添加剂[4]。

近些年来，在养殖业生产过程中，大量持续的使用抗生素等化学类饲料添加剂，使得动物胃肠道菌群失调，产生了药物残留和耐药性等问题。但迄今，尚没有一种单一的措施能够对动物起到完全的保护作用。目前的趋势是向日粮中添加一些益生素来促进动物消化道有益微生物区系的形成。

酵母培养物因绿色、无耐药性、营养丰富、能提高动物生产性能等优点已经越来越受到国内外饲养业的重视，许多国外产品已进入我国，但价格十分昂贵，市场价格高于10 000元人民币/t。我国是饲料养殖大国，按照我国目前养殖规模，酵母培养物的需求量在百万吨以上，但由于价格因素，目前使用量不足万吨[5]。而我国白酒年产量约600万吨，白酒生产的副产物——白酒糟（湿）超过1 000万吨。利用白酒糟生产酵母培养物，既可以充分利用这一废物，减少它对环境的污染，又可提高白酒糟的营养价值，使其成为新型饲料添加剂，创造出更大的经济价值[6]。

因此，本课题以廉价的白酒糟为主要基质，接种酿酒酵母，进行酵母高密度固体发酵后，在此固体基质上进行酵母自溶处理，摸索酵母在白酒糟固体培养基中增殖后的最佳自溶条件。最终确定实验室以白酒糟为基质生产酵母培养物的工艺条件，以期成功实现白酒糟的生物转化。

1 材料与方法

1.1 试验材料

白酒糟由湖北十堰白泉酒业有限公司提供；36%～37%分析纯甲醛溶液由湖北奥生新材料科技有限公司生产；12 U/mg木瓜蛋白酶由Biosharp公司生产；酿酒酵母（白酒型活性干酵母）：由湖北宜昌安琪酵母股份有限公司提供。

1.2 试验方法

1.2.1 初始自溶条件的设定

调整经过酵母高密度固体发酵后的固体酒糟基质初始pH值为6，向其中添加助溶剂：9%(w/w湿糟)的NaCl溶液（以下用A表示），0.03%(w/w湿糟)木瓜蛋白酶溶液（以下用B表示）以及9%(v/w湿糟)体积分数为95%的助溶剂无水乙醇（以下用C表示），控制助溶剂添加总体积与酒糟干基总质量的体积质量比为1∶1，搅拌分散，保持55℃自溶48 h。

1.2.2 助溶剂的选择

取8组以相同条件经酵母高密度发酵所得的白酒糟，添加助溶剂：一组只添加A，一组只添加B，一组只添加C，一组添加A+B的组合，一组添加B+C的组合，一组添加A+C的组合，一组混合添加上述三种助溶剂，另设对照组(CK)不添加任何助溶剂，按照初始条件进行自溶处理，以氨态氮含量为指标确定最适助溶剂。

1.2.3 自溶时间的选择

按照初始条件进行自溶处理，每隔6 h取出测定氨态氮的含量，持续至60 h结束，确定最适自溶时间。

1.2.4 自溶初始pH值的选择

以CaO粉末和稀硫酸调整每组酒糟基质pH值分别为5、6(自然)、7、8，按照初始条件进行自溶处理，测定氨态氮含量，确定最适自溶初始pH值。

1.2.5 自溶温度的选择

设定各组自溶温度分别为40、45、50、55、60 ℃，并设对照组为常温，按照初始条件进行自溶处理，测定各组氨态氮含量，确定最适自溶温度。

1.2.6 自溶加水比的选择

控制助溶剂添加总体积与酒糟干基总质量的体积质量比0.5∶1、0.75∶1、1∶1、1.5∶1，并设对照不加水，按照初始条件进行自溶处理，测定各组氨态氮含量，确定最适自溶加水比。

1.2.7 无水乙醇加量的选择

向各组经过相同条件酵母高密度固体发酵后的酒糟基质中添加助溶剂：9%(w/w湿糟)的NaCl溶液，0.03%(w/w湿糟)木瓜蛋白酶溶液，1.5%、3%、6%、9%、12%(v/w湿糟)体积分数为95%的无水乙醇，并设对照不添加无水乙醇，按照初始条件进行自溶处理，测定各组氨态氮含量，确定最适无水乙醇添加量。

1.2.8 加盐量的选择

向各组经过相同条件酵母高密度固体发酵后的酒糟基质中添加助溶剂：3%、6%、9%、12%(w/w湿糟)的NaCl溶液，并设对照不添加NaCl溶液，以及0.03%(w/w湿糟)木瓜蛋白酶溶液，9%(v/w湿糟)体积分数为95%的无水乙醇，按照初始条件进行自溶处理，测定各组氨态氮含量，确定最适加盐量。

1.2.9 加酶量的选择

向各组经过相同条件酵母高密度固体发酵后的酒糟基质中添加助溶剂：9%(w/w湿糟)的NaCl溶液，9%(v/w湿糟)体积分数为95%的无水乙醇，0.01%、0.02%、0.03%、0.04%(w/w湿糟)的木瓜蛋白酶溶液，酶液添加前先在39～40℃的温水中活化，以增加其活力[7]。并设对照不添加木瓜蛋白酶溶液，按初始条件进行自溶，测定各组氨态氮含量，确定最适加酶量。

1.2.10 正交试验设计

研究不同的pH值、温度、加水比、乙醇加量、加盐量、加酶量6个因素对酵母自溶的影响，设计6因素3水平的正交试验。自溶后测定各组氨态氮含量，得到最佳自溶条件。数据处理与分析采用正交设计助手Ⅱv3.1统计软件进行直观分析。

1.2.11 指标测定方法

试验中氨态氮含量的测定采用甲醛滴定法[8]。

2 结果与分析

2.1 助溶剂的选择

酵母自溶添加自溶促进剂（助溶剂）能提高细胞渗透性，加速自溶过程[9]，提高氨态氮的含量，同时可以防止细胞腐败，改善饲料风味[10]，如添加食盐[11]、醋酸乙酯[12]、蛋白酶[13]、硫胺素[14]、无水乙醇[15]等。在选择合适助溶剂并给予合适自溶条件下，酵母细胞内源酶活力增加，分解细胞质且使细胞膜逐渐失去选择性，可溶性化合物即可渗透析出，随着细胞膜渗透性的增加，细胞外也出现了蛋白质分解，自溶产物最终大部分以氨基酸态氮的形式存在。

本试验在设定的初始条件下采用不同助溶剂，以自溶后氨态氮含量为指标确定最佳助溶剂，试验结果如图1所示。其中，A代表NaCl溶液，B代表木瓜蛋白酶溶液，C代表无水乙醇。

图1 不同助溶剂对氨态氮含量的影响

由图1可知，采用三种助溶剂混合的方法氨态氮产量最高，因此我们选定助溶剂为NaCl溶液、木瓜蛋白酶溶液和无水乙醇这三种溶液的混合液。

2.2 自溶时间的选择

酵母的自溶过程很缓慢，为了确定酵母自溶的最佳时间，我们以样品氨态氮含量为指标，将自溶时间延至60 h，每隔6 h测定氨态氮含量，试验结果如图2所示。

从图2可知，随着自溶时间的延长，氨态氮含量不断提高，经过一定时间后，氨态氮的增加明显变慢。自溶36 h之前，随时间的延长，氨态氨含量不断提高。自溶36 h以后，氨态氨含量增加不再明显，考虑到工业生产中，自溶时间过长占用时间，影响设备利用率[16]，且自溶时间过久，自溶产物略带氨味，影响风味，因此将自溶时间确定为36 h[10]。

图2 不同自溶时间对氨态氮含量的影响

2.3 自溶初始pH值的选择

酶促降解蛋白质是酵母自溶的关键[17]，pH值影响着酵母细胞内酶的活性，从而影响产品的风味品质和蛋白质的降解程度。据报道，酵母胞内蛋白酶作用的最适pH值多为微酸偏中性[18]，在自溶过程中胞内磷脂酶、核酸酶、蛋白酶的激活使碳水化合物、核酸、蛋白质释放，自溶后pH值显著下降，因此初始pH值不宜过低[7]。但也不宜过高，pH值大于8，自溶液容易变质发臭[19]。因此本试验选取pH值5、6（自然pH值）、7、8作为试验范围。试验结果如图3所示。从图3中看出，pH值为7时自溶样品氨态氮含量最高，正交试验选择pH值为6、7、8。

图3 不同自溶初始pH值对氨态氮含量的影响

2.4 自溶温度的选择

有研究者从酵母细胞中分离到4种蛋白酶，一种外切肽酶，最适作用温度30～35℃；三种内切肽酶，其中一种内切肽酶的最适作用温度为60℃左右，另外两种的最适作用温度均为50℃左右。因此，酵母自溶温度多为55℃左右[17]。适宜的自溶温度可以提高这些酶的活性。本研究以自溶后氨态氮含量为指标选取40、45、50、55、60 ℃以及常温做单因素试验[20]，试验结果如图4所示。

从图4看出，50℃条件下自溶效果最好，自溶后氨态氮含量达到2.97 mg/g干糟，正交试验选择温度为45、50、55 ℃。

图4 不同自溶温度对氨态氮含量的影响

2.5 自溶加水比的选择

加水比需适中，超过一定的加水比，氨基酸态氮溢出量处于平衡，且增加干燥能耗。据有关文献报道，试验选取1∶1、1.5∶1、0.5∶1等5种加水比[10]。试验结果如图5所示。

从图5中看出，当加水比为1∶1时，自溶后氨态氮含量最大，达到3.02 mg/g干糟。从经济、节能的角度考虑，正交试验选择0.75∶1、1∶1、1.25∶1 3个加水比。

图5 不同自溶加水比对氨态氮含量的影响

2.6 助溶剂无水乙醇加量的选择

乙醇是酵母自溶促进剂[21]，它可以溶解脂肪，促进细胞膜渗透性的提高[22]，并抑制细菌的腐败。在后续处理中可通过加热浓缩将乙醇去除[15]。乙醇用量低于1.5%时，自溶样品易变质腐败，考虑到工业生产，本试验选取乙醇添加量为1.5%～12%。试验结果如图6所示。

图6 不同无水乙醇添加量对氨态氮含量的影响

从图6可以看出，随着乙醇用量的增加，自溶样品氨态氮含量也在增加，超过9%时氨态氮的含量略有下降[15]。正交试验选择6%、9%、12%（v/w湿糟）三个乙醇用量。

2.7 加盐量的选择

食盐具防腐、调味、除臭等作用，可减轻苦味，去除酵母味，是较理想的质壁分离剂[7]。但食盐用量在12%以上，成本较高，且干燥后产品中食盐含量高，将直接影响产品的口感和品质[23]，因此本试验选取3%、6%、9%、12%以及对照5种用量。试验结果如图7所示。

由图7见，随着NaCl添加量的增加，自溶后样品中氨态氮含量也增加，NaCl添加量为9%和12%时氨态氮含量差别不大，正交试验选择6%、9%、12%（w/w湿糟）3个NaCl添加量。

图7 不同加盐量对氨态氮含量的影响

2.8 加酶量的选择

蛋白质的酶促降解在酵母自溶过程中起着重要作用[24]，它贯穿于整个酵母自溶过程中。但酵母细胞内源酶活力有限，随着自溶进行，其活力不断降低[25]，因而使得自溶效果和时间都受到了限制，通过外加木瓜蛋白酶可有效的改善这种状况。

试验结果如图8所示，添加木瓜蛋白酶浓度在0.03%和0.04%时氨态氮含量差别不大。正交试验选择0.02%、0.03%、0.04%（w/w湿糟）三个木瓜蛋白酶添加量。

图8 不同加酶量对氨态氮含量的影响

2.9 酵母自溶条件正交试验结果

对影响酵母自溶的几个因素进行单因素试验后，设计六因素三水平的正交试验。通过正交试验L18(3)6找到酵母自溶最佳条件，以自溶结束后样品中氨态氮含量作为衡量试验结果的指标，试验因素水平设计见表1，正交试验结果见表2。

由表2可以看出：各个因素对自溶效果的影响顺序为：pH值＞温度＞加水比＞加酶量＞NaCl加量＞乙醇加量，最佳试验条件为A1B3C2D2E1F3。按照优化后的试验条件进行3次重复验证试验，所测得氨态氮含量分别为3.92、3.79、3.81 mg/g干糟，平均值为3.83 mg/g干糟，相当于24%的酵母细胞自溶率。在优化的自溶条件下，氨态氮的平均值比最好的12号试验结果的氨态氮值有所提高。

表1 正交试验设计

表2 正交试验结果

3 结论

经上述试验得出酵母高密度发酵白酒糟后的最佳自溶条件为：以稀硫酸调整酵母细胞高密度固态发酵后的固体酒糟基质初始pH值为6，向其中添加助溶剂：6%(w/w湿糟)的NaCl溶液，0.04%(w/w湿糟)木瓜蛋白酶溶液以及9%(v/w湿糟)体积分数为95%的助溶剂无水乙醇，控制助溶剂添加总体积与酒糟干基总质量的体积质量比为1∶1，搅拌分散，保持55℃自溶36 h，而后干燥粉碎。所获得的产品包括酵母细胞赖以生长的固体基质，酵母菌体以及酵母细胞外代谢产物。与初始自溶条件下2.78 mg/g干糟的氨态氮数值相比，优化后的自溶条件下氨态氮值提高了37.8%。

4 讨论

本课题所确定的酵母培养物生产工艺是在实验室水平上得出的，大规模工业生产还有待进一步研究。若将其应用于工业生产，以下部分有待完善：

①解决白酒糟大量堆积易长霉菌的问题。可以尝试筛选一种既能抑制白酒糟霉菌生长又不影响酵母生长的益生菌与酵母共同接种培养，使得原料保存期更长，使用更方便。

②进一步降低酵母培养物生产成本，简化生产工艺。有研究显示，酵母自溶物本身富含各种氨基酸、B族维生素、多种金属离子及NaCl，这些物质均可有效促进酵母自溶。对于酵母自溶来说，其产品本身就是一种复合助溶剂[26]。因此我们可以尝试取适量以上述实验方法自溶后的酒糟掺到未经自溶处理的酵母酒糟基质中并混合均匀，促进后者酵母自溶，反复利用，达到便于操作、节约成本的目的，以利工业扩大化生产。

③确定该产品最适添加量。应当在生产工艺确定的基础上，对产品的营养成分进行分析测定，并以不同添加量进行动物饲喂试验，观察并记录使用效果，以饲喂后所要达到的目的为指标确定产品最适添加量。

④检测该产品的有效性和安全性。酵母培养物成分复杂，含有“未知促生长因子”，因此不能仅以自溶后氨态氮含量作为衡量指标。要开发出实用的检测方法和科学的检测标准，对酵母培养物的安全性和有效性进行检测，以保证产品的工业化生产[27]。