餐厨废物腐败过程中微生物的变化及检测

■张严化 杨曙明 赵璐瑶

（中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所农业部农产品质量安全重点实验室，北京 100081）

我国餐厨废弃物排放量大且产量日益增加。据中国统计年鉴，全国城市生活垃圾产出量年增长速度为6%～8%，2001年我国城市生活垃圾超过13 000万吨，餐厨废弃物占总量的30%～40%。2003～2008年，部分都市餐厨废弃物日均产量：北京1 050 t、上海1 300 t、深圳600 t、杭州622 t。2010～2012年北京市某街道的218家餐饮单位中只有42.2%的餐饮单位进行分类，无害化处理的餐厨废弃物占总量的54.1%，其中资源化利用比例为28.7%。餐厨废弃物资源化方法主要有：饲料化、堆肥、制备生物柴油及生物制氢等。饲料化存在安全问题，对消毒要求的提高，导致处理成本增加；堆肥占地面积较大，周期长，易产臭气；制备生物柴油、乙醇等副产品存在产品纯度问题且生产成本过高；生物制氢技术处于研究阶段，且产氢气发酵的连续性、稳定性较低。目前，我国的餐厨废弃物无正规安全可行的处理方法，餐厨废弃物私自收运，处置不规范的情况严重，资源化利用水平较低，时刻影响环境和人类的健康。如何实现餐厨废弃物资源化和缩减处理量，是我国正面临的一个迫切需要解决的问题。

1 餐厨废弃物的饲料化

餐厨废弃物营养物质含量丰富、有机物含量高，是可开发的饲料资源。毛文成等测定了烘干餐厨废弃物主要成分的含量：干物质22.4%、粗蛋白21.4%、粗脂肪27.2%。陈园等利用羊肚菌对餐厨废弃物和辅料豆渣混合物进行发酵，获得的饲料符合国家蛋白饲料标准。Yiying Jin等测得饲料用餐厨废弃物于110℃下湿热处理60 min，金黄色葡萄球菌、总大肠杆菌、菌落总数等卫生指标显著降低，得出110℃湿热处理60 min是一种有效的餐厨废弃物加工为饲料前的杀菌方法。Wing Yin Mo等用含53%谷物不含肉类的餐厨废弃物和含25%肉类、28%谷类的餐厨废弃物制作的鱼饲料，与金丰®613混合饲料对鱼的生长无显著的差异。餐厨废弃物用作饲料虽存在安全隐患，但可通过不同的加工处理方法，提高安全性。饲料化已成为餐厨废弃物资源化的重要发展方向，经济、社会、环境效益大，产业化前景可观。

餐厨废弃物经餐饮单位收集、暂存，统一由加工处理企业定期收集、转运后，经粉碎、脱水、加氮中和、高温杀菌后接种酵母进行发酵，再经干燥、磨粉、化验及包装制成饲料。餐厨废弃物从产生、收集、储运到加工为饲料前的变化是不可控的未知状态。毛文成等初步探索了餐厨废弃物腐败的表征性指标及腐败进程中的规律，但此过程中微生物的变化是不确定的。餐厨废弃物腐败主要是由微生物引起的，也会发黏、变稠，产生不正常气味并伴有大量的有毒有害代谢物（生物胺、真菌毒素等）产生，影响产品的质量安全。经调查，餐厨废弃物资源化利用企业判定餐厨废弃物是否可用的方法是无气味、无变色、无大量异常气泡，不含大量水分和杂物，pH值在4～7。可见，对于加工前餐厨废弃物的筛选粗略模糊，不能正确反映餐厨废弃物在转运过程中的质量变化。

餐厨废弃物加工成为饲料的过程中，关键就在于源头的品质的保证。加工前餐厨废弃物的品质是保证其安全性的关键。因此，研究餐厨废弃物中微生物的变化并加以控制，使加工前的储运阶段处于可控状态，可为饲料化利用提供可靠原料，并为餐厨废弃物的安全评价提供基础支撑。

2 微生物在食品腐败过程中的变化

餐厨废弃物富含蛋白质、淀粉、纤维素、脂肪等有机物，含有丰富的氮、磷、钾、钙及各种微量元素，有利于微生物的生长，餐厨废弃物中可能含有大肠杆菌、沙门氏菌等致病菌。餐厨废弃物在收集、储运过程中极易污染微生物，在适宜的环境条件下，微生物可以大量繁殖，使成分复杂的餐厨废弃物发生一系列变化，引起腐败变质。

2.1 微生物生长规律

微生物生长繁殖的速度非常快。适宜条件下细菌可在20～30 min内分裂1次，若不断快速地分裂，短时间内可达惊人的数目。但实际上微生物是按一定的规律生长、繁殖、衰亡的。稳定的培养条件下，一般微生物菌体要经历延滞期、对数期、稳定期和衰亡期。李向阳通过测定大肠杆菌、白色葡萄球菌在不同温度、酸度、抑菌药物和促菌作用下的热功率-时间曲线对各条件下生长速率常数的关系进行研究，得出测定菌的最适生长温度、酸度及药物抑菌作用下最低用药浓度，药物促菌作用下最高用药浓度。董硕等研究了蔬菜发酵过程中乳酸菌的生长规律，发现乳酸菌在发酵菜汤汁pH值＞5.0时起主要作用；pH值＜5.0，乳酸杆菌逐渐成为优势菌。且在发酵前期，细菌也大量生长，而后随pH值的降低受到抑制。

微生物的生长繁殖是内外各种环境因素相互作用的综合反映，因此微生物的生长繁殖情况除了可作为研究生理、生化及遗传等问题的指标外，还可作为反映所处环境变化的指标。因而，可以通过测定微生物的生长变化的规律来探索餐厨废弃物品质的变化规律，从而控制餐厨废弃物加工前的质量安全，提高餐厨废弃物的利用率。

2.2 优势菌

食品种类繁多、组成及理化性质不同。受到微生物污染后，食品中优势菌种不同。优势菌可有选择地分解食品成分，并具有特征性。如分解蛋白能力较强的细菌有芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、变形杆菌属(Proteus)等。分解脂肪能力较强的细菌有荧光假单胞菌（Ps fluorescens）、无色杆菌属(Achromobacter)、产碱杆菌属(Alcaligens)。

包英才等筛选出鲜切青椒的腐败组织中优势菌株，得到两种优势菌株，反接测定其中一株为优势腐败菌，经API鉴定是欧文氏菌。郭光平研究了烧鸡腐败菌菌相，认为烧鸡腐败初始主要优势腐败菌以假单胞菌属（47.58%）和葡萄球菌属（31.34%）为主、其次为乳酸菌(8.06%)和肠杆菌科(11.40%)。Hu等研究发现，弯曲乳杆菌（Lactobacillus curvatus）和清酒乳杆菌（Lactobacillus sakei）是切片真空包装火腿的主要优势菌。Hovda等研究了气调包装后养殖的大西洋鳕鱼的菌群变化。结果表明，假单胞菌（Pseudomonas spp）是氧浓度较高的包装中，大西洋鳕鱼的主要优势菌；而发光杆菌（Photobacterium sp.）、假单胞菌（Pseudomonas spp）和腐败希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens）是CO2/N2和空气包装中主要的腐败菌。党秋玲等研究了生活垃圾堆肥过程中细菌群落的变化。发现在升温期，堆肥堆体中有H.obtusa和人类排泄物中的细菌生长；随温度的升高，嗜热微生物Clostridium thermocellum成为高温期的优势细菌。结合食品中优势菌的筛选方法，可通过对餐厨废弃物进行基质分类，测定不同基质组成中餐厨废弃物优势菌的变化，对分离的优势菌进行数目变化规律的测定来反映餐厨废弃物的腐败情况。

3 食品腐败过程中影响微生物生长的因素

某种食品被微生物污染后，不是任何一种微生物都能生长繁殖。微生物能否在这种食品上生长繁殖，与食品的基质条件及环境因素有关。同样，餐厨废弃物中微生物的种类、数目与基质类型和收运环境有关。因而可通过调节环境因素结合物理、化学、生物等方法对餐厨废弃物中的微生物进行调控。

3.1 基质条件

餐厨废弃物中富含蛋白质、淀粉、纤维素、脂肪等有机物，还含有丰富矿物元素，营养素齐全。但餐厨废弃物成分比例复杂且差异大，不同微生物对营养物质要求不同，导致了引起食品腐败的微生物类群不同。以肉、鱼等富含蛋白质的肉菜型为主餐厨废弃物，容易受到蛋白质分解能力很强的变形杆菌、青霉等微生物的污染而发生腐败；以米饭等含糖较高的面食为主的餐厨废弃物易受到曲霉属、根霉属、乳酸菌、啤酒酵母等对碳水化合物分解能力较强的微生物的污染而变质；而脂肪含量较高的油水型餐厨废弃物，易受到黄曲霉和假单胞杆菌等分解脂肪能力很强的微生物的污染而发生酸败变质。

史宏伟等以餐厨垃圾、果蔬垃圾、麦秸3种不同原料分别进行厌氧消化，研究了最佳运行条件下各反应器的微生物群落组成。发现3组样品中细菌和古菌的群落存在相同的优势微生物，但其数量和群落结构差异也较为明显，细菌中以拟杆菌(Bacteroidetes)以及古菌中甲烷鬃菌属(Methonosaeta)和甲烷螺菌属(Methanospirillum)均为样品共有的优势微生物。

3.2 氢离子的浓度

氢离子浓度对微生物的生命活动有很大影响。氢离子浓度会影响到菌体细胞膜上电荷的性质。正常细胞膜上的电荷，是有利于某些营养物质的吸收。当食品中氢离子浓度致使微生物细胞膜上的电荷发生改变时，微生物对某些物质的吸收机能就发生改变，从而影响了细胞正常物质代谢活动。pH值的高低决定着食品的细菌菌相，是制约微生物生长并影响食品腐败变质的重要因素之一。张玉静等研究了中温条件下pH值对餐厨废弃物厌氧发酵生产挥发性脂肪酸的影响，得出厌氧发酵产酸的最佳pH值为6.0。当食品的pH值在4.5以下时，除少数酵母、霉菌和乳酸菌属细菌等耐酸菌外，大部分致病菌可被抑制或杀死。张学峰等研究了志贺氏菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌3种致病菌在四川泡菜发酵期间的菌落数及pH值分析，发现pH值随发酵时间的延长而下降，3种致病菌均受到抑制，pH值为3.4～3.6时，志贺氏菌不能存活；pH值为3.56～3.7时，沙门氏菌不能存活；pH值为3.6时，金黄色葡萄球菌仍然存在。可以通过添加有机酸等调节餐厨废弃物的pH值来控制餐厨废弃物中微生物的变化，有选择性的调节餐厨废弃物中微生物的生长。

3.3 水分

微生物在食品上生长繁殖，除需要一定的营养物质外，还必须有足够的水分，主要取决于食品的水活度（Aw）的大小。不同类型微生物都有生长适宜的水分活性范围，同一类型的微生物，在不同条件下生长发育所需要的最低水分活性值也有差异。张纪利等通过检测真菌、霉菌、大肠杆菌等的数量，研究了不同初始水分物料在有机肥发酵过程对微生物数量的影响，得出初始物料55%水分，于第一次翻堆时，补足水分至65%，最有利于发酵。张朦通过测定不同水活度条件下大肠杆菌在面包中的生长曲线，建立了25℃条件下大肠杆菌的生存预测模型，并在此模型基础上讨论了大肠杆菌指数增殖期生长系数与水活度的关系，得到大肠杆菌在面包的水活度的质控指标为0.93。Santillana Farakos等研究了温度、水分活度及水分流动性对低水分活度食品中沙门氏菌的影响，发现Aw对沙门氏菌存活影响较大且耐热性随着Aw降低而增强；相同Aw下，水分流动性对沙门氏菌的影响不显著。餐厨废弃物含水量高，为微生物生长提供有利的环境，可通过溧水处理，分类存放含水量不同的餐厨废弃物等方法来降低微生物的生长速度。

3.4 渗透压

渗透压与微生物的生命活动有一定的关系。一般微生物在低渗透压的食品中较易生长，而在高渗食品中，常因脱水而死亡。当然不同微生物种类对渗透压的耐受能力大不相同。绝大多数细菌不能在较高渗透压的条件下生长，只有少数种能在高渗透压环境中生长，如盐杆菌属（Halobacterium)中的一些种群，可在食盐浓度达20%～30%的食品中生活；肠膜明串珠菌能耐高浓度糖；而霉菌和酵母菌一般能耐受较高的渗透压。翁佩芳分析了榨菜低盐腌制过程微生物群落多样性，发现5%盐度腌制榨菜前期优势菌群为乳杆菌属(Lactobacillus)、明串珠菌属（Leuconostoc)和魏斯氏菌属(Weissella)；7%盐浓度腌制的榨菜前期优势乳酸菌为希腊魏斯氏菌(Weissella hellenica)，后期起主导作用的种群均为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。微生物放在含有大量可溶性物质如糖或盐的溶液里，将失去水分，细胞发生质壁分离，代谢停止。虽然酵母和霉菌抵抗渗透压变化的能力较强，但基于此原理的食品保存法仍然有效。有研究发现，骤变或超过一定限度的渗透压可以抑制微生物的生长，甚至导致微生物的死亡。因而，可通过调节餐厨废弃物基质成分的比例及适当的糖、盐、水含量的调节来控制餐厨废弃物的渗透压，控制微生物的生长。

3.5 温度

温度是影响食品腐败变质的重要因素。每种微生物都有最适生长温度范围，但大都可在25～30℃之间生长繁殖。我国的餐厨废弃物在收运前大多处于这一温度范围的环境中，也是餐厨废弃物易以腐败的原因之一。降低食品温度，可以有效地抑制微生物的生长繁殖，降低酶的活性和餐厨废弃物内化学反应的速度，有利于保证质量。马妍等检验了在3种常用的冷藏温度下贮藏河豚鱼的微生物特性及与品质变化有关的指标。发现0℃冷藏能有效延长货架期，抑制河豚鱼中优势腐败菌的生长，延缓鱼肉品质的下降。李轶等研究了不同温度、初始pH值对餐厨垃圾和牛粪混合厌氧发酵的影响，发现温度为50℃时，初始pH值为7时，厌氧发酵效果最佳。通常，餐厨废弃物在夏季的腐败速度快，收运的餐厨废弃物到达处理公司之前就已腐败变质，造成资源的浪费。而冬季时的腐败速度则较慢，可以通过低温收运延迟餐厨废弃物的腐败。

3.6 化学添加物

添加食品防腐剂是常用的食品保藏方法。国家食品添加剂标准中规定的能够用于食品保藏的化学物质多数是有机酸（盐），少数是天然防腐剂。特定的食品中添加特定的化学添加剂可以有效地延缓食品的腐败变质。龙峥等研究了三种不同配比的复合保鲜剂对冷鲜肉品质影响，结果表明，不同配比的复合保鲜剂均能不同程度的延长冷鲜肉保鲜期，配比为0.2%茶多酚+2%乳酸钠+0.15%乳酸+0.03%Nisin的复合保鲜剂，延长冷鲜肉保质期效果最佳。乳酸链球菌素（Nisin）是一种安全的天然防腐剂，但作用范围相对较窄，仅对大多数革兰氏阳性菌(G+)具有抑制作用。近年研究证明，甘氨酸对大肠菌和枯草菌抑制效果显著，对芽孢萌发也有抑制作用。苏氨酸、丝氨酸及维生素B1、维生素K也有良好的防腐效果。利用拮抗微生物或天然杀菌素以控制食品中本身存有的致病菌生长。如乳酸菌具有拮抗肠道内病原菌的作用，可通过产生有机酸、双乙酞和细菌素等多种代谢产物，抑制食品中的腐败菌和病原菌。S.J.Sathe等探索了从不同果蔬中分离出乳酸菌的抗霉菌能力，检验其抗黄曲霉的活性（共359株），其中10%菌株具有抗真菌活性。

可通过调配基质成分、更改餐厨废弃物体系糖、盐分的含量改变其渗透压及添加有机酸等调节其酸碱度来改变原有的体系环境，调控餐厨废弃物中微生物的生长与变化，提高餐厨废弃物资源化利用率。

4 微生物检测方法

传统微生物检验方法的检测周期长、检测过程复杂、耗费大量的人力物力。餐厨废弃物成分复杂多变，致使其微生物群落结构复杂且是未知的，因而用传统的检测方法需耗费大量时间。餐厨废弃物中微生物的检测需结合现代快速的检测技术与传统方法。

4.1 荧光定量PCR

荧光定量PCR技术，除了具有常规PCR的快速、灵敏、操作方便等特点外，还无需凝胶电泳等PCR后处理，减小对环境的污染，操作安全；定量准确且仪器可在线实时监测，结果直观。Fusco等根据金黄色葡萄球菌肠毒素基因组(egc)设计引物，利用TaqMan探针和SYBR Green染料两种方法检测生牛奶中的金黄色葡萄球菌，两种方法对金黄色葡萄球菌的检测特异性都接近100%且检测灵敏度高。Wang等建立了牛奶中的大肠杆菌O157:H7的实时荧光定量PCR法，灵敏度可达102CFU/ml。Leblanc-Mandor等建立了检测猪类便中弯曲菌的荧光定量PCR方法。Bai JF等利用大肠杆菌O157:H7的(f1iC，stx1，stx2，eae，rfbE和h1yA)基因建立多重PCR方法，在不增菌的检测限为104CFU/g，6 h增菌后的检测限为10 CFU/g。Kimata用含12对引物的多重PCR检测肠道致病菌时，每种模板在107CFU时能测出所有的基因片段。利用荧光定量PCR法测定餐厨废弃物中致病菌具有可行性，检测周期短，24 h内可以完成，且可以对细菌进行定量，比传统的致病菌检测法具有时效性。

4.2 PCR-DGGE技术

PCR-DGGE技术是将PCR和变性梯度凝胶电泳的(DGGE)分析技术结合起来将长度相同而序列不同的DNA片段混合物分离开的一项技术，广泛用于微生物多样性的检测。Kesmen等利用PCR-DGGE技术和传统培养法，分析鉴定了一种土耳其发酵肠中乳酸菌的菌落结构。Pennacchia等利用PCR-DGGE结合传统培养法分析比较真空包装和未包装冷却牛肉中的腐败菌多样性，发现不同包装方式的冷却牛肉中微生物群落结构差异较大。Leite等利用PCR-DGGE技术和传统培养法研究了三种不同巴西谷物中微生物的群落结构及多样性，发现高加索酸奶乳杆菌（Lactobacillus kefiri）和马乳酒样乳杆菌（Lactobacillus kefiranofaciens）是三种谷物中主要的微生物。张国华研究发现不同地区传统面食发酵剂的优势菌主要有魏斯氏菌属（Weissella）、乳杆菌属(Lactobacillus)和明串珠菌属（Leuconostoc）。彭绪亚等利用PCR-DGGE技术研究了不同负荷下单相餐厨废弃物厌氧消化反应器内微生物群落结构演替特征，发现有机负荷在 2.0～8.5 kg/(m3·d)下微生物群落结构有明显的阶段性演替，且 7.0 kg/(m3·d)时微生物群落结构丰富度最好。刘建国等利用PCRDGGE技术探索了餐厨废弃物乳酸发酵过程中微生物种群动态变化，发现未灭菌接种的发酵体系中微生物的多样性高于灭菌后接种的发酵体系，且乳酸产量前者高于后者，同时测得不灭菌接种的发酵体系中含大量土著乳酸菌。Cocolin等利用PCR-DGGE法分析火鸡肉、不同产地的羔羊肉和鸡肉样品中提取的总DNA，发现新鲜原料肉中微生物群落结构复杂，主要腐败菌为热死环丝菌、木糖葡萄球菌和弯曲乳杆菌。党秋玲等运用PCR-DGGE技术研究了生活垃圾堆肥过程中细菌群落的变化，发现在堆肥的不同时期，细菌群落发生更替，常温期和高温期微生物群落结构差别较大。

5 结语

餐厨废弃物具有高水分，有机物质含量丰富，成分复杂、时空差异明显的特点，极易腐败，危害性、资源性并存。各种处理方法中生物处理尤其是饲料化具有很大的资源潜力。由于餐厨废弃物从产生到加工前的储运阶段微生物的变化过程是不可控制的未知状态，可能会导致生产的饲料中一些有微生物产生的有害物质超标，造成资源不能有效利用。保证饲料产品的安全关键就在于源头餐厨废弃物的品质的保证。因此，从微生物方面研究餐厨废弃物加工前的腐败情况，使加工前的储运阶段处于可控状态，可为饲料化利用提供可靠原料，提高餐厨废弃物的利用率，降低餐厨废弃物处理成本，并为餐厨废弃物的安全评价提供基础支撑。同时也可作为其他生物处理技术提供基础数据，促进餐厨废弃物的资源化利用的发展。

（参考文献52篇，刊略，需者可函索）