lncRNA FGD5-AS1靶向miR-421对缺氧/复氧诱导的心肌细胞损伤的影响

孟晓京，刘亚军，项宁

秦皇岛市第一医院，河北秦皇岛 066000

众所周知，心血管疾病是全世界最致命的疾病。缺血再灌注（I/R）损伤是最常见的心血管疾病病理因素［1］。目前，非编码RNA［包括微小RNA（miRNA）和长链非编码RNA（lncRNA）］在心肌I/R损伤机制研究中已成为热门［2］。研究显示，lncRNA FGD5-AS1在牙周炎患者中表达下调，上调其表达可减轻脂多糖（LPS）诱导的牙周膜细胞损伤［3］。lncRNA FGD5-AS1在糖氧剥夺诱导的神经元损伤中低表达，其过表达可减轻糖氧剥夺诱导的神经元损伤［4］。miR-421在缺氧/复氧诱导的心肌细胞损伤中表达上调，下调其表达可抑制细胞凋亡从而减轻缺氧/复氧诱导的心肌细胞损伤［5］。但lncRNA FGD5-AS1在缺氧/复氧诱导的心肌细胞中的表达与功能研究较少。2018年11月—2020年6月，本研究利用缺氧/复氧诱导心肌细胞，复制心肌I/R损伤模型，考察lncRNA FGD5-AS1在其中的表达及其对心肌细胞凋亡和氧化应激的影响，并探讨其可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料 大鼠心肌细胞H9C2购自上海生物科学研究所细胞资源中心，PrimeScript RT、SYBR Premix Ex TaqⅡ试剂盒购自日本TaKaRa公司，MiScript逆转录试剂盒、MiScript SYBR-Green PCR试剂盒购自德 国Qiagen公 司，pcDNA、pcDNA-FGD5-AS1、anti-miR-NC、anti-miR-421、si-NC、si-FGD5-AS1、miRNC、miR-421购自上海GenePharma公司，丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的检测试剂盒均购自江苏碧云天生物技术公司，膜联蛋白V（Annexin V）-FITC细胞凋亡试剂盒购自美国BD Pharmingen公司，细胞裂解缓冲液购自上海Sangon Biotech公司，pMIR GLO载体、双荧光素酶活性测定系统购自美国Promega公司。

1.2 细胞培养与缺氧/复氧处理 心肌细胞在补充了10%胎牛血清（FBS）的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中于37℃、5%CO2中培养。取心肌细胞，将其分为Con组和H/R组。Con组未进行处理；H/R组进行缺氧/复氧处理，即将心肌细胞在缺氧培养箱（95%N2、5%CO2）中缺氧培养3 h，然后在常规培养箱（95%空气、5%CO2）中复氧培养4 h［6］。

1.3 心肌细胞lncRNA FGD5-AS1和miR-421检测 采用实时荧光定量PCR。用TRIzol试剂提取Con组、H/R组细胞的总RNA。使用PrimeScript RT试剂盒或MiScript逆转录试剂盒进行逆转录，SYBR Premix Ex TaqⅡ或MiScript SYBR-Green PCR试剂盒在7900HT实时PCR系统上进行PCR，lncRNA FGD5-AS1以GAPDH为内参，miR-421以U6为内参。lncRNA FGD5-AS1引物序列分别为5'-AACAGTGCCTATGTGGACGG-3'（正向）和5'-CCCATCACAGAGGTCCACAC-3'（反向）；miR-421引物序列分别为5'-GCGCGGATCAACAGACATTAATT-3'（正向）和5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'（反向）；GAPDH引物序列分别为5'-ACACCCACTCCTCCACCTTT-3'（正向）和5'-TTACTCCTTGGAGGCCATGT-3'（反向）；U6引物序列分别为5'-CGCTTCGGCAGCACATATACTAA-3'（正向）和5'-TATGGAACGCTTCACGAATTTGC-3'（反向）。PCR反应条件：95℃10 min，95℃15 s，60℃1 min，40个循环。使用2-ΔΔCt法计算lncRNA FGD5-AS1和miR-421的相对表达量。

1.4 细胞分组及处理 将心肌细胞分为Con组、H/R组、H/R+pcDNA组、H/R+pcDNA-FGD5-AS1组、H/R+anti-miR-NC组、H/R+anti-miR-421组、pcDNA组、pcDNA-FGD5-AS1组、si-NC组、si-FGD5-AS1组、H/R+pcDNA-FGD5-AS1+miR-NC组、H/R+pcDNA-FGD5-AS1+miR-421组。按照制造商的说明使用Lipofectamine2000进行转染。转染48 h后，按照1.3采用实时荧光定量PCR评估转染效率。随后，根据不同实验目的参照1.2进行缺氧/复氧处理。Con组未处理，H/R组以缺氧/复氧处理，H/R+pcDNA组进行pcDNA转染与缺氧/复氧处理，H/R+pcDNA-FGD5-AS1组进行pcDNA-FGD5-AS1转染与缺氧/复氧处理，H/R+anti-miR-NC组进行anti-miRNC转染与缺氧/复氧处理，H/R+anti-miR-421组进行anti-miR-421转染与缺氧/复氧处理，pcDNA组转染pcDNA，pcDNA-FGD5-AS1组转染pcDNA-FGD5-AS1，si-NC组转染si-NC，si-FGD5-AS1组转染si-FGD5-AS1，H/R+pcDNA-FGD5-AS1+mi R-NC组同时转染pcDNA-FGD5-AS1、miR-NC并进行缺氧/复氧处理，H/R+pcDNA-FGD5-AS1+miR-421组同时转染pcDNA-FGD5-AS1、miR-421并进行缺氧/复氧处理。

1.5 心肌细胞MDA含量和SOD、GSH-Px活性检测 根据MDA、SOD、GSH-Px检测试剂盒的操作步骤，收集1.4各组心肌细胞上清液，以硫代巴比妥酸法检测MDA含量，氮蓝四唑显色法检测SOD活性，NADPH法检测GSH-Px活性。

1.6 心肌细胞凋亡率测算 采用流式细胞术。将1.4各组心肌细胞在冰冷的PBS液中洗涤两次，1 000 r/min离心10 min，然后加入100μL结合缓冲液。混合后，添加5μL Annexin V-FITC和碘化丙啶（PI）。将心肌细胞在室温下黑暗中孵育15 min，补充400μL结合缓冲液，并使用BD Pharmingen流式细胞仪测量细胞凋亡。FlowJo软件分析凋亡数据。

1.7 心肌细胞抗B细胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bax）检测 采用Western blotting法。将1.4各组心肌细胞在细胞裂解缓冲液中裂解以提取总蛋白。用12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶分离等量的蛋白质（50μg），然后将蛋白凝胶转移到制备的聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。选择5%脱脂脱脂牛奶/TBST来封闭所有PVDF膜，膜与抗B细胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bax）和GAPDH一抗（1：1 000稀释）在4℃孵育过夜，随后与二抗一起孵育。以增强型化学发光试剂进行蛋白信号检测。

1.8 lncRNA FGD5-AS1与miR-421靶向调控验证 采用生物信息学预测与双荧光素酶报告实验。根据从LncBase Predicted v.2获得的数据，预测出lncRNA FGD5-AS1部分核苷酸序列可与miR-421互补配对。分别扩增包括假定的miR-421结合序列的lncRNA FGD5-AS1两种类型（野生型WT、突变体MUT）序列，然后将扩增的序列克隆到pMIR GLO载体中，以产生荧光素酶报告质粒WT-FGD5-AS1或MUT-FGD5-AS1。然后，使用Lipofectamine2000将荧光素酶报告质粒WT-FGD5-AS1或MUT-FGD5-AS1和miR-421或miR-NC共转染。转染后48 h，选择双荧光素酶活性测定系统评估每组荧光素酶活性。

1.9 统计学方法 使用SPSS22.0统计软件。计量资料以±s表示，两组间比较采用配对t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 缺氧/复氧对心肌细胞损伤的影响 H/R组lncRNA FGD5-AS1的相对表达量（0.45±0.04）低于Con组（1.00±0.06），miR-421的相对表达量（3.21±0.27）高于Con组（1.00±0.05），P均＜0.05。缺氧/复氧对心肌细胞损伤的影响见表1。

表1 缺氧/复氧对心肌细胞损伤的影响（±s）

表1 缺氧/复氧对心肌细胞损伤的影响（±s）

注：与Con组比较，*P＜0.05。

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2.2 lncRNA FGD5-AS1过表达对缺氧/复氧诱导的心肌细胞损伤的影响 H/R+pcDNA组、H/R+pcDNAFGD5-AS1组lncRNA FGD5-AS1的相对表达量分别为0.42±0.04、1.78±0.14，H/R+pcDNA组与H/R+pcDNA-FGD5-AS1组相比，P＜0.05。lncRNAFGD5-AS1过表达对缺氧/复氧诱导的心肌细胞损伤的影响见表2。

表2 lncRNA FGD5-AS1过表达对缺氧/复氧诱导的心肌细胞损伤的影响（±s）

表2 lncRNA FGD5-AS1过表达对缺氧/复氧诱导的心肌细胞损伤的影响（±s）

注：与H/R+pcDNA组比较，*P＜0.05。

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2.3 抑制miR-421表达对缺氧/复氧诱导的心肌细胞损伤的影响 H/R+anti-miR-NC组、H/R+anti-miR-421组mi R-421的相对表达量分别为1.00±0.05、0.30±0.03，两者比较P＜0.05。抑制miR-421表达对缺氧/复氧诱导的心肌细胞损伤的影响见表3。

表3 抑制miR-421表达对缺氧/复氧诱导的心肌细胞损伤的影响（±s）

表3 抑制miR-421表达对缺氧/复氧诱导的心肌细胞损伤的影响（±s）

注：与H/R+anti-mi R-NC组比较，*P＜0.05。

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2.4 lncRNA FGD5-AS1靶向调控miR-421的表达 WT-FGD5-AS1与miR-421共转染的荧光素酶活性（0.51±0.04）低于WT-FGD5-AS1与miR-NC共转 染（1.03±0.08），P＜0.05。MUT-FGD5-AS1与miR-421、miR-NC共转染的荧光素酶活性分别为1.04±0.06、1.01±0.07，两者相比差异无统计学意义。pcDNA-FGD5-AS1组、pcDNA组mi R-421相对表达量分别为0.35±0.04、1.00±0.06，两者相比P＜0.05；si-FGD5-AS1组、si-NC组mi R-421相对表达量分别为2.99±0.22、1.01±0.04，两者相比P＜0.05。

2.5 lncRNA FGD5-AS1、miR-421表达上调对缺氧/复氧诱导的心肌细胞损伤的作用 见表4。与H/R+pcDNA-FGD5-AS1+mi R-NC组（1.00±0.07）比较，H/R+pcDNA-FGD5-AS1+miR-421组心肌细胞miR-421相对表达量（2.61±0.22）增加（P＜0.05）。lncRNA FGD5-AS1、miR-421表达上调对缺氧/复氧诱导的心肌细胞损伤的影响见表4。

表4 lncRNA FGD5-AS1、miR-421表达上调对缺氧/复氧诱导的心肌细胞损伤的影响（±s）

表4 lncRNA FGD5-AS1、miR-421表达上调对缺氧/复氧诱导的心肌细胞损伤的影响（±s）

注：与H/R+pcDNA-FGD5-AS1+miR-NC组比较，*P＜0.05。

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3 讨论

心肌I/R损伤是一种常见的围手术期并发症，增加患者病死率。在缺氧期间，尤其是在复氧阶段，氧化应激和活性氧的大量增加激活了线粒体的凋亡程序，触发了半胱天冬酶的级联反应，最终导致心肌细胞凋亡［7-8］。心肌细胞凋亡有助于心肌I/R损伤后心肌细胞的丢失并抑制左心室的重塑，并且心肌细胞凋亡的增加与心肌I/R损伤后心力衰竭的发生呈正相关［9］。因此，心肌细胞的凋亡是导致心肌I/R损伤后心力衰竭的关键促进因素［10］。抑制心肌细胞的凋亡对于预防和治疗心肌I/R损伤具有重要意义。众所周知，MDA是氧化应激标记，SOD和GSH-Px是抗氧化酶，检查它们的水平可以评估细胞的氧化应激［11］。本项研究中，缺氧/复氧使心肌细胞中SOD活性、GSH-Px活性、Bcl-2蛋白表达减少，并使MDA含量、凋亡率、Bax蛋白表达增多，与之前研究［11］一致，表明缺氧/复氧处理心肌细胞成功诱导心肌I/R损伤。

lncRNA可以在表观遗传、翻译或转录水平上调节基因的表达。越来越多的研究表明，lncRNA在心血管疾病的发病机制中，尤其是在心肌梗死和I/R损伤中起重要作用［12］。lncRNA不仅起miRNA海绵的作用，还通过调节下游靶点参与心肌细胞的自噬、细胞凋亡和坏死［13］。此外，组织特异性和稳定表达的特性使lncRNA有望成为疾病诊断的生物标志物［14］。lncRNA FGD5-AS1是非小细胞肺癌［15］、结直肠癌［16］、口腔癌［17］等肿瘤的致癌因子，在癌症中高表达，可以促进非小细胞肺癌的细胞增殖，结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭，而抑制FGD5-AS1具有抑制口腔癌细胞生长、迁移和侵袭，但促进细胞凋亡的作用［15-17］。lncRNA FGD5-AS1在牙周炎中失调［18］，被确定为急性心肌梗死的关键lncRNA［19］，但lncRNA FGD5-AS1在心肌I/R损伤中的生物学功能仍不清楚。本研究发现，lncRNA FGD5-AS1在缺氧/复氧诱导的心肌细胞H9C2中表达下调。lncRNA FGD5-AS1过表达时，缺氧/复氧诱导的心肌细胞的MDA含量、凋亡率、Bax蛋白表达降低，SOD活性、GSH-Px活性、Bcl-2蛋白表达升高。这些数据支持lncRNA FGD5-AS1是心肌I/R的保护分子，其作用是通过减少细胞凋亡和改善氧化应激来发挥的。

lncRNA的已知功能包括转录调控、结合蛋白和mi RNA海绵，与各种心血管疾病的发生和发展密切相关。lncRNA上存在大量的miRNA结合位点，这些结合位点通过碱基互补与目标miRNA的特定序列特异性结合，从而充当miRNA海绵［20］，如miR-107［15］、miR-302e［16］是lncRNA FGD5-AS1促进 非小细胞肺癌、结直肠癌进展的功能性靶标。miR-421此前已被证明在脑I/R损伤中高表达，下调miR-421表达可减少神经功能缺损和梗死体积，并可下调MDA含量，上调SOD活性，促进髓样细胞白血病-1和Bcl-2的表达，并下调缺血皮质中Bax的表达。下调miR-421表达通过抑制细胞凋亡和氧化应激减轻脑I/R损伤［21］。miR-421敲低导致缺氧/复氧诱导的H9c2细胞凋亡减少，乳酸脱氢酶和MDA水平降低以及SOD水平升高［5］。WANG等［22］证明miR-421通过靶向Pink1来调节线粒体片段化和心肌梗死。此外，使用antagomir敲低miR-421可抑制心肌细胞中的线粒体片段化和凋亡。本研究发现，缺氧/复氧诱导的心肌细胞中miR-421的表达上调，抑制miR-421表达可以降低缺氧/复氧诱导的心肌细胞的MDA含量、凋亡率、Bax蛋白表达，提高SOD活性、GSH-Px活性、Bcl-2蛋白表达，与前人研究［5］相符。基于生物学信息分析、荧光素酶报告测定和PCR的测定，本研究确定了lncRNA FGD5-AS1与miR-421的靶向关系。另外，上调miR-421表达后，lncRNA FGD5-AS1过表达对缺氧/复氧诱导的心肌细胞损伤的保护作用被逆转，表现为共转染pcDNA-FGD5-AS1和mi R-421提高缺氧/复氧诱导的心肌细胞的MDA含量、凋亡率、Bax蛋白表达，降低SOD活性、GSH-Px活性、Bcl-2蛋白表达。这说明在缺氧/复氧条件下，lncRNA FGD5-AS1对心肌细胞凋亡和氧化应激的调控作用是通过靶向miR-421来实现的。

总之，lncRNA FGD5-AS1在缺氧/复氧诱导的心肌细胞中下调，lncRNA FGD5-AS1过表达降低细胞凋亡，减轻氧化应激，其可能是lncRNA FGD5-AS1通过靶向调控mi R-421的表达实现的。这些结果为探索急性心肌梗死的新型分子靶向疗法提供了有用的信息。