2型糖尿病肾病患者血清miR-92b-5p和HMGB1水平变化及临床意义

陈晨，李晶，叶婷，李惠

新疆医科大学附属中医医院，乌鲁木齐 830000

2017年全球约有4.51亿糖尿病患者，预计到2045年，糖尿病患者人数将增加到6.93亿，同时，接近一半（49.7%）的糖尿病患者未得到诊断［1］。糖尿病肾病是糖尿病常见且严重的并发症之一，主要为肾小球和肾小管微血管病变，主要表现为持续性蛋白尿和肾小球滤过率进行性下降［2］。研究发现，miR-92b-3p可通过靶向糖尿病肾病大鼠中的Smad7介导晚期糖基化终产物（RAGE）诱导的肾脏异常发育［3］。而同属于miR-92b家族的miR-92b-5p最早被发现与心房颤动和心衰等心脏疾病关系密切［4］，但有关糖尿病肾病患者miR-92b-5p表达情况及其与糖尿病肾病发病的关系目前尚未阐明。高迁移率族蛋白Box1（HMGB1）是一种分布在肾脏等重要器官高度保守的非组蛋白核蛋白，其作为促炎细胞因子，可通过激活Toll样受体（TLR）2、TLR4或RAGE而介导多种炎性疾病的发生和发展［5-6］。HMGB1通过介导RAGE的产生和增加NF-κB的激活而诱发糖尿病大鼠的肾脏损伤［7］，因此阻断HMGB1及其受体之间相互作用可预防糖尿病肾病的发展。鉴于此，本研究旨在探讨血清中miR-92b-5p及HMGB1在糖尿病肾病发生发展过程中的作用，并分析其对糖尿病肾病的诊断及预测价值，为糖尿病肾病的诊断及治疗提供一定的理论基础。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2019年1—12月及2020年4—7月于我院就诊的203例2型糖尿病患者为研究对象，其中男92例、女111例，年龄26～80（62.44±10.81）岁，依据是否合并肾病将患者分为单纯糖尿病组（n=98）和糖尿病肾病组（n=105），并纳入80例同期体检健康者为对照组，其中男41例、女39例，年龄（63.10±10.80）岁。纳入标准：2型糖尿病患者符合《中国2型糖尿病防治指南（2017年版）》［8］中的诊断标准；2型糖尿病肾病的诊断根据《糖尿病肾病防治专家共识（2014年版）》［9］符合以下两者之一即可：①糖尿病视网膜病变伴任何一期慢性肾脏病，②白蛋白尿；受试者年龄在18～80岁。排除标准：其他类型糖尿病或合并原发性或其他继发性肾脏病；近期患急性感染性疾病；近期应用糖皮质激素或免疫抑制剂；合并恶性肿瘤等其他严重疾病；有透析史或肾移植病史。本研究经医院伦理委员会批准，所有研究对象签署知情同意书。

1.2 一般情况及常规检验指标收集 完整记录各组年龄、性别、高血压史、BMI、饮酒史、吸烟史，并记录入院时的实验室常规化验指标，包括胆固醇（TC）、甘油三脂（TG）、高密度脂蛋白（HDL-C）、低密度脂蛋白（LDL-C）、糖化血红蛋白（HbA1c）、空腹血糖（FBG）、24 h尿蛋白（24 hpro）、肌酐，计算估算肾小球滤过率（eGFR）=［（140-年龄）×体质量（kg）×88.4］/［72×肌酐（mmol/L）］（女性×0.85）。

1.3 血清miR-92b-5p和HMGB1检测 采集所有受试者空腹血9 mL，加入EDTA管中，血清的分离工作于4 h内完成，以4℃3 000 r/min（离心半径8 cm），离心15 min，分离血清，后将其转移至无RNA酶及DNA酶的EP管中，并存于-80℃冰箱备用。HMGB1采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测，ELISA试剂盒购自武汉优尔生科技公司，依照提供的说明书完成检测。采用实时荧光定量PCR法检测miR-92b-5p mRNA：将血清从-80℃冰箱取出置于冰上解冻，采用TRIzol裂解液（Invitrogen公司，美国）对血清提取总RNA，之后采用cDNA逆转录试剂盒（TaKaRa公司，日本）将提取出的总RNA按500 ng体系（反应条件为37℃15 min、85℃5 s），逆转录为cDNA；取1μL cDNA、10μL SYBR Premix Ex TaqⅡ（TaKaRa公司，日本）和1μL miR-92b-5p特异性引物按20μL体系，使用Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR系统（Thermo Fisher，新加坡）进行扩增。miR-92b-5p的循环条件：95℃30 s，95℃5 s，60℃34 s，40个循环。miR-92b-5p上游引物序列为5'-AGGGACGGGACGCGGTGCAGTG-3'，下游引物序列为5'-GCGAFCACAGAATTAATACGAC-3'；内参基因U6上游引物序列为5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3'，下游引物序列为5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'。每个样品重复3次上样，采用2-ΔΔCt法测定miR-92b-5p的相对表达量。

1.4 统计学方法 采用SPSS23.0统计软件。计量资料以±s表示（经正态性检验并符合正态分布时），两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验；计数资料以例（%）表示，多组间比较采用χ2检验；相关因素分析采用多因素Logistic回归分析；预测价值根据绘制的ROC曲线进行分析，采用Pearson检验进行相关性分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组临床特征比较 见表1。

表1 各组临床特征比较

2.2 2型糖尿病患者进展为糖尿病肾病的危险因素分析 将表1中具有统计学差异的指标进行多因素Logistic回归分析（α入=0.05，α出=0.10），以是否合并肾病为因变量，以HbA1c、FBG、24 hpro、eGFR、肌酐、miR-92b-5p及HMGB1水平为自变量。结果显示，HMGB1和24 hpro水平升高与miR-92b-5p和eGFR水平降低均是2型糖尿病患者进展为糖尿病肾病的独立危险因素（P均＜0.05），见表2。

表2 2型糖尿病患者是否合并肾病的危险因素分析

2.3 2型糖尿病患者血清miR-92b-5p、HMGB1与24 hpro、eGFR的相关性 2型糖尿病患者血清mi R-92b-5p水平与HMGB1（r=-0.297）和24 hpro（r=-0.388）水平均呈负相关，miR-92b-5p与eGFR（r=0.406）水平呈正相关；HMGB1和24 hpro（r=0.573）水平均呈正相关，与eGFR（r=-0.601）水平呈负相关（P均＜0.05）。

2.4 血清miR-92b-5p和HMGB1对2型糖尿病肾病的预测价值 根据ROC曲线分析结果，miR-92b-5p对应的最佳诊断阈值为2.967，敏感性为82.9%、特异性为63.7%；HMGB1对应的最佳诊断阈值为72.08μg/L，敏感性为72.4%，特异性为90.8%；二者联合对2型糖尿病患者进展为糖尿病肾病的预测价值均高于miR-92b-5p（Z=2.208，P=0.027）或HMGB1（Z=2.327，P=0.030）单一检测，见表3。

表3 血清miR-92b-5p和HMGB1对2型糖尿病肾病的预测价值

3 讨论

随着肥胖患者数量的增加，2型糖尿病的患病率在全球范围内呈上升趋势，大约25%的2型糖尿病患者可进展为糖尿病肾病，其是终末期肾病的主要原因［10］。糖尿病肾病的常见病理特征包括细胞外基质蛋白聚集，系膜细胞增生、肥大以及肾小球足细胞功能障碍［6］。糖尿病肾病发病机制较为复杂且缺乏有效的诊断方法，常规检测手段存在一定的局限性，例如目前临床对糖尿病肾病的诊断和监测试验包括尿白蛋白和eGFR，但在蛋白尿发生之前约有三分之一的患者肾功能下降，因此单独检测蛋白尿不足以监测糖尿病肾病的发生和发展［11］，故寻找新的糖尿病肾病诊断性标志物或发病的危险因素，并进行早期识别和治疗对防治糖尿病肾病至关重要。

miRNA通过识别靶基因的3′-UTR而诱导靶基因的降解，可抑制蛋白质翻译过程，调节多种生理反应及病理过程。既往研究发现miRNA可参与调节机体的生长与分化、炎症反应、氧化应激、血管生成等，与炎症、内分泌疾病等多种疾病关系密切［12］。而miRNA对机体的病理生理变化反应灵敏且性质稳定，提示其可作为疾病诊断及预后评估的新型标志物［12］。近期研究发现miR-92b在肾脏多种病理生理过程中发挥作用，例如其可靶向调控水通道蛋白2而减轻肾水肿［13］，miR-92b-5p最早在心房颤动和心衰等心脏疾病中被发现，而在脊髓损伤模型中发现miR-92b-5p表达水平与IL-18结合蛋白的表达相关，继而通过调控IL-18来介导炎症反应［14］。IL-18在肾组织中表达，并在包括高血糖在内的多种刺激下上调。而炎症反应可直接破坏肾脏结构，在糖尿病肾病的病理生理过程中起重要作用，其中IL-18较IL-1、IL-6、肿瘤坏死因子-α和巨噬细胞趋化蛋白-1等其他炎性因子在糖尿病肾病发病中所起作用更具特异性，IL-18表达与糖尿病肾病的进展及尿白蛋白排泄率呈正相关［15］。因此我们推测miR-92b-5p与糖尿病肾病的发病可能存在相关性。HMGB1是一种作为基因表达辅助因子的核蛋白，几乎在所有细胞类型中普遍存在。在细胞核中HMGB1通过以非特异性序列方式结合DNA来支持染色质的结构，并参与基因的转录调控、DNA修复和细胞分化等多种生物学功能，其主要细胞受体是RAGE，而RAGE在包括心脏、肾脏、大脑、嗜中性粒细胞、淋巴细胞等多种组织和细胞中均有表达，HMGB1通过与RAGE结合而发挥促炎、促进细胞迁移和侵袭等多种生物学作用［6］。HMGB1表达升高可激活如CDC42/Rac、MAPK/NF-κB等炎症信号通路而加重肾脏的炎症反应，导致炎性细胞浸润程度升高［16］；研究表明，高血糖可诱导HMGB1从活化的肾细胞中释放并刺激RAGE受体和TLR4而发挥促炎作用，引起肾小管间质炎症而导致肾损伤，最终导致糖尿病肾病的发生［17-18］。上述研究提示，糖尿病患者mi R-92b-5p水平降低及HMGB1表达升高诱发的炎症反应可能在糖尿病肾病发病过程中发挥重要作用。

本研究结果显示，2型糖尿病肾病患者的HMGB1水平高于单纯糖尿病患者和体检健康者，而mi R-92b-5p水平低于单纯糖尿病患者和体检健康者。进一步Logistic回归分析发现，2型糖尿病患者HMGB1水平升高与mi R-92b-5p水平降低是其进展为糖尿病肾病的危险因素。既往研究发现在糖尿病发生时，HMGB1由受损肾组织释放并在肾细胞胞质中高表达，且HMGB1水平高低与肾脏炎症和氧化应激水平成正相关，升高的HMGB1可激活MAPK/NF-κB、TLR等多种炎症信号通路共同参与糖尿病肾病炎性损伤的发病机制［7，16，19］。研究发现在大鼠糖尿病肾病模型中，miR-92b-5p表达降低而HMGB1表达升高，模型鼠24 hpro、尿素氮和血清肌酐水平均升高，HE染色观察到肾小球系膜和基底膜小管炎性细胞的浸润程度明显升高并伴明显的增生和肿胀，进而该研究发现过表达miR-92b-5p可显著抑制含有野生型HMGB1质粒的萤光素酶活性，提示miR-92b-5p表达升高可靶向下调HMGB1的表达［20］，因此当miR-92b-5p表达降低时可靶向上调HMGB1的表达，继而激活与HMGB1相关的炎症反应信号通路，参与糖尿病肾病的发生与发展。同时本研究相关性分析发现miR-92b-5p与HMGB1水平呈负相关，且mi R-92b-5p、HMGB1与24 hpro、eGFR均有一定的相关性，说明miR-92b-5p降低导致HMGB1水平升高可能通过导致肾小球系膜和基底膜小管炎性细胞的浸润程度升高继而导致基底膜小管和肾小球系膜增生和肿胀，最终导致尿白蛋白的升高和肾小球滤过率的下降。进一步ROC曲线结果显示血清miR-92b-5p和HMGB1水平对2型糖尿病患者进展为糖尿病肾病有一定的预测价值，且二者联合对2型糖尿病进展为糖尿病肾病的预测价值高于单独检测，提示早期联合检测两指标可作为临床预测2型糖尿病肾病发生及进展的标志物。

综上所述，血清HMGB1水平升高和miR-92b-5p水平降低是2型糖尿病向糖尿病肾病进展的危险因素，早期联合检测两指标可作为辅助预测2型糖尿病肾病发生的标志物。但本研究为单中心、小样本研究，需扩大样本量并开展多中心研究进一步验证研究结果。