远志正丁醇提取物对SH-SY5Y 细胞增殖及抗氧化损伤作用

★ 李翊 杨改红 乔日发 罗涛 罗小泉 袁金斌（.江西省人民医院风湿免疫科 南昌0006；.江西中医药大学现代中药制剂教育部重点实验室 南昌 0004；.南昌大学第一附属医院 南昌 0006）

老年原发性退化性痴呆，即阿尔茨海默病（Alzheimer"s disease，AD），是以记忆力损害和认知功能减退为主要特征的中枢神经系统退行性脑病［1］。随着世界人口老龄化的趋势，AD与癌症、心血管病和脑卒成为了严重威胁老年人健康的四大疾病，对该病的防治成为了社会的重点难点。

关于AD发生机制的学说众多，主要有胆碱能损伤假说，自由基损伤假说，Aβ级联假说，钙稳态失调假说，免疫炎症假说和能量障碍与兴奋毒性假说［2］。其中公认可信度较高的学说之一就是自由基损伤假说［3］。自由基损伤是指活性氧(reactive oxygen species, ROS)在细胞生成增加、清除减少时，发生氧化应激，体内代谢产生的过氧化氢（H2O2）易穿透细胞膜，降低抗氧化酶的活性，造成脂质和蛋白质等生物大分子物质受损，对神经细胞造成毒性，从而诱导神经元的损伤和死亡，因此H2O2是氧化应激相关研究的理想模型药物［4-5］。

AD实验中，体外细胞模型是较为直观便捷的实验手段，其中 SH-SY5Y 细胞单一，不易掺杂其他细胞，生长繁殖比较快，培养周期短，生理和生化功能类似于正常神经细胞，使用方便，易控制，可用作为研究神经元损伤和药物作用的体外理想模型［6］。

远志，始载于《神农本草经》，被列为上品，为远志科植物远志（Polygala tenuifoliaWild.）或卵叶远志（Polygala sibiricaL.）的干燥根，具有益智、安神的功效，多用于失眠多梦、健忘心悸和神志恍惚［7］。已有研究表明远志具有保护神经作用［8］，本实验采用远志正丁醇提取物来研究其对H2O2诱导SH-SY5Y细胞损伤模型的保护作用，为远志在与氧化损伤相关的神经退行性疾病的研究提供依据。

1 实验材料

1.1 药材与试剂药材远志，产于陕西，购自河北省安国市瑞琪中药材有限公司，经江西中医药大学教育部重点实验室杨武亮教授鉴定，为远志科植物远志（Polygala tenuifoliaWilld.）的干燥根皮。DMEM/F12（1∶1）培养基（美国GIBCO）；胎牛血清（美国GIBCO）；0.25 %不含EDTA的胰蛋白酶消化液（索莱宝公司）；DMSO（ACS Grade）；MTT（索莱宝公司）；乙醇（无水乙醇，分析纯，西陇化工股份有限公司）；乙酸乙酯（分析纯，天津市永大化学试剂有限公司）；正丁醇（分析纯，西陇化工股份有限公司）；0.22 μm微孔滤膜（JET BIOFIL），Lot No.140115-052；无菌注射器（规格：10 mL），批号：140407。

1.2 仪器CO2细胞培养箱（SANYO MCO175，SERIAL NO.09070073）；超净工作台（型号：SW-CJ-2FD，苏州苏杰净化设备有限公司）；灭菌锅（型号：S/N970774，日本Sanyo公司）；台式高速离心机（型号：H1650，湘仪离心机仪器有限公司）；倒置相差显微镜（型号：XDS-1B，日本尼康）；十万分之一电子天平（型号：BT25S，德国Sartorius公司）。

1.3 细胞SH-SY5Y细胞，购自中科院上海细胞库，批号：43016819113601。SH-SY5Y细胞培养于含10 %灭活胎牛血清和1 %青霉素-链霉素的DMEM/F12（1∶1）培养液中。于37 ℃、5 % CO2培养箱中培养，待细胞生长至铺满培养基底部80 %及以上时，用0.25 %胰酶消化传代，取对数生长期细胞进行实验。

2 方法

2.1 远志正丁醇提取物的制备和药物溶液配制远志的乙醇提取物：准确称取300 g远志干燥根粗粉，置圆底烧瓶中，加入1000 mL70 %乙醇，回流提取3次,每次2 h。合并提取液，减压回收溶剂，浓缩成浸膏。

远志的正丁醇提取物［9］：将上述所得浸膏用适量蒸馏水溶解,过滤后，每次取滤液数毫升加相同体积的乙酸乙酯萃取3次，弃去乙酸乙酯层；合并萃取剩余液，每次取数毫升并加入相同体积的正丁醇萃取3次，合并萃取液后，回收正丁醇，将所得的浸膏完全干燥后称重约得20.5 g远志总皂苷粗提物。称取约40 mg远志总皂苷粗提物，溶于10 mL培养液（10 % FBS）中，配成浓度为4 mg/mL的药物原液，再用培养液稀释成实验用各浓度点药物溶液。

2.2 确定诱导SH-SY5Y细胞所需的H2O2浓度及诱导时间将细胞接种后（细胞密度为3×104个细胞/mL），分对照组（加入完全培养基，但不加H2O2）、空白组（只加入等体积的培养液）和5个H2O2损伤组，每组6个复孔，接种24 h后观察，48 h后损伤组加入H2O2至终浓度分别为10 μmol/L，50 μmol/L，100 μmol/L，150 μmol/L和242.5 μmol/L，孵育1、2 h后于倒置显微镜观察细胞的形态，弃去部分上清液，加入终浓度为0.5 mg/mL的MTT，37 ℃，5 % CO2浓度下孵育4 h，弃去大部分上清液，加入150 μL的DMSO，于摇床上震荡10 min使结晶完全溶解，酶标仪于570 nm处测定吸光度值，计算细胞存活率（见图1）。实验表明，随着时间的延长，从1 h到2 h，H2O2对SH-SY5Y细胞损伤有小幅的增大，使细胞存活率略有下降。当H2O2作用2 h，随着H2O2浓度的增加，细胞的存活率不断下降，当H2O2浓度达到150 μmol/L时，细胞的存活率为52.4 %，与242.5 μmol/L差别很小，故选择H2O2浓度150 μmol/L，作用2 h作为H2O2对SH-SY5Y细胞损伤的模型。

图1 不同浓度的H2O2对细胞活力的影响

2.3 不同浓度远志正丁醇提取物对SH-SY5Y细胞增殖的影响将SH-SY5Y 细胞按5×104个细胞/mL，接种于96孔培养板中，每孔200 μL，置于孵箱中孵育24 h后，分为对照组，远志正丁醇提取物不同药物浓度组（5、10、20、40、80和100 μg/mL），每组设6个复孔，每次试验重复3次。各给药组加入相应的含药培养基200 μL，并使其为药物终浓度，对照组加入等量的空白培养液，37 ℃，5 % CO2条件下培养48 h。在作用结束前4 h，每孔加入终浓度为0.5 mg/mL的MTT，继续培养4 h进行显色反应，弃去上清液，每孔加入100 %的二甲基亚砜150 μL，待孔内颗粒完全溶解后，用酶联免疫检测仪测定570 nm处的吸光度值（OD）。

所得各组数据按下式计算 SH-SY5Y 细胞的增殖率：

实验数据以吸光度值和增殖率（%）表示。应用SPSS软件17.0作统计分析，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05或P＜0.01为差异有统计学意义。

结果显示（图2），不同浓度的远志正丁醇提取物对 SH-SY5Y 细胞均显示一定的增殖作用，5 μg/mL，10 μg/mL的药物浓度与对照组相比，有显著性差异（P＜0.05）。经显微镜观察，与对照组相比，48 h之后，各药物浓度对细胞均有一定的增殖作用，在≥300 μg/mL的药物浓度下，多数细胞胞体变圆，突起回缩或消失；在5 μg/mL，10 μg/mL药物浓度下（如图3），细胞长势较好，细胞胞体较大，细胞间的突触细长、交织。

图2 不同浓度的远志正丁醇提取物对正常SH-SY5Y细胞活力的影响

图3 不同浓度的远志正丁醇提取物对SH-SY5Y细胞形态的影响（×200）

2.4 不同浓度的远志正丁醇提取物对SH-SY5Y细胞损伤的影响将细胞按5×104个/孔的密度接种于96孔板后，分为对照组（加入完全培养基，但不加H2O2），空白组（不接种细胞也不加H2O2，加入相同体积的培养液），3个损伤组（给药+ H2O2）和1个H2O2损伤模型组，每组6个复孔，接种24 h后观察，3个损伤组分别给与浓度为10、20和40 μg/mL的药物溶液预培养，24 h后损伤组和损伤模型组分别加入H2O2至终浓度为150 μmol/L孵育1 h后于倒置显微镜下观察细胞的形态，拍照后，小心吸弃部分上清液，加入终浓度为0.5 mg/mL的MTT，37 ℃，5 % CO2浓度下孵育4 h，弃去大部分上清液，加入150 μL的DMSO，于摇床上震荡10 min使结晶完全溶解，酶标仪于570 nm处测定吸光度值，计算细胞存活率。

与对照组相比，实验组的细胞存活率为：

实验结果表明（图4），与对照组相比，模型组明显抑制了细胞的生长；与模型组相比，不同浓度药物保护作用下的细胞存活率有所上升，10 μg/mL浓度下的细胞存活率明显较高。显微观察下（图5），模型组细胞突触消失，胞体回缩变圆，给药组的细胞，突触部分收缩，细胞形态变化不大。

图4 不同浓度的远志正丁醇提取物对细胞存活率的影响

图5 远志正丁醇提取物（10 μg/mL）对模型细胞的保护作用（×200）

3 讨论与总结

神经退行性疾病的发病机制较复杂，相关研究中涉及较多的就有氧化损伤［10］。H2O2作为体内的ROS主要来源，产生过多时容易损伤细胞，因此H2O2是氧化应激相关研究中的理想模型药物。1970年，一位神经母细胞瘤患者的转移骨瘤灶细胞SK-N-SH被克隆3次后产生的亚系（SKN-SH→SH-SY→SH-SY5→SH-SY5Y）成为了SHSY5Y细胞，该肿瘤细胞分化程度较低，在细胞形态、生理及生化功能与正常神经细胞相似，并具有明显的轴突［6］，因此SH-SY5Y细胞常被作为拟神经细胞使用，H2O2作用于体外培养的SH-SY5Y细胞，造成氧化损伤，已经被广泛用于研究氧化应激诱导的神经细胞损伤模型［11-17］。

据《神农本草经》记载，远志“利九窍，益智慧，耳目聪明，不忘，强志倍力”，《药性论》“治心神健忘”，《本草纲目》“其功专于强志益精，治善忘”，可见远志自古以来就具有安神益智的功效，而且在现代研究中也证明了远志具有保护神经作用［8,15,16,17］。据文献报道［18,19］，远志皂苷是远志抗老年痴呆的一类有效成分，本实验对远志醇提物进一步纯化，先后采用乙酸乙酯和正丁醇萃取，得到远志总皂苷粗提物，考察其对SH-SY5Y细胞增殖的影响。

本实验表明：与对照组相比，100 μg/mL以下各浓度的远志正丁醇提取物对正常SH-SY5Y细胞的生长均有一定的增殖作用，而5 μg/mL和10 μg/mL的药物浓度能显著的促进SH-SY5Y细胞的增殖。与对照组相比，损伤模型组明显抑制了细胞的生长；与模型组相比，在不同浓度的远志正丁醇提取物保护作用下的细胞存活率均有所上升，10 μg/mL浓度下的细胞存活率明显较高。