葛根素对老年大鼠心肌细胞氧化应激的影响

宋福成，邓 靖，杨海沛，张之剑，孙玉敏

(1.武警第一机动总队医院 门诊部，河北 定州073000；2.武警第一机动总队医院 卫生防疫科，河北 定州066000；3.武警第一机动总队医院 外二科，河北 定州066000；4.沧州医学高等专科学校 内科，河北 沧州061001)

葛根素(7，4’-二羟基-8-C-葡萄糖基异黄酮)是从多年生豆科植物葛根中提取的异黄酮[1-2]。多年来，它在我国传统医学中被广泛应用于心血管疾病的临床治疗，包括心肌梗塞、脑缺血、心绞痛和高血压。葛根素对心脏功能有保护作用，防止缺血再灌注损伤，改善心肌代谢和减少梗塞面积。已有学者发现，葛根素可以通过减少活性氧的产生、避免线粒体膜电位的崩溃、减轻后续细胞凋亡来保护心肌细胞免受缺血再灌注损伤[3]，但关于葛根素对老年大鼠心肌细胞氧化应激的影响尚无报道。本研究通过观察不同浓度葛根素对老年大鼠心肌细胞氧化应激的影响，旨在探讨葛根素的心肌保护机制，为心血管病的防治提供依据。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂CKX31 型倒置相差显微镜(日本 Olympus 公司)，MCO-18AIC 型 CO2培养箱(日本Sanyo公司)，超声波细胞粉碎机(宁波，新芝公司)，BIO-RAD680 型酶标仪 (上海天呈科技有限公司)，DU800紫外分光光度计(美国 Beckman公司)，细胞培养板(美国，Corning公司)。

葛根素(购自中国药品生物制品检定所，批号110752-201301，白色粉末状，20 mg/支，纯度96%)，胎牛血清、胰蛋白酶(上海酶联生物科技有限公司)，DMEM 培养液、青霉素、链霉素(美国 Gibco 公司)，噻唑蓝(MTT，美国 Ameresco 公司)。丙二醛(malonaldehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、总抗氧化能力(total antioxidant capacity,T-AOC)试剂盒(南京建成生物科技有限公司)。

含葛根素培养液的配制：取适量的葛根素，配置终浓度为1、10、100、250 μg/mL 的培养液。

1.2 原代培养老年大鼠心肌细胞正常健康清洁级20-24月龄SD老年大鼠。 腹腔注射肝素约 10 min 后，颈椎脱臼处死，分离左心室。用胰酶(1 mg/mL)在D-Hanks平衡盐溶液中消化。离心回收细胞，重新悬浮在平板培养基(DMEM，100 U/mL青霉素和链霉素)中，并预先平板在预涂有1%明胶(37℃，30 min)的60 mm培养皿上，以除去非肌细胞。将未贴壁的心肌细胞以每皿1×106个细胞接种在明胶包被的60 mm培养皿上。18 h后，在实验期间，将心肌细胞洗涤并在无血清维持培养基(DMEM、100 U/ml青霉素和链霉素)中培养。分别在实验前用葛根素处理细胞[4]。

1.3 心肌细胞增殖情况的MTT法检测胰酶消化细胞，制备单个细胞悬液(细胞密度为 1×106个/ml)。向 96 孔板滴加细胞悬液，每孔200 μl，置于培养箱培养 12 h，待细胞稳定贴壁生长后，分别作用于含终浓度为 0、1、10、100、250 μg/ml葛根素的培养液培养 24、48、72 h，设 6 复孔。每孔加入 5.0 mg/ml 的 MTT 溶液 20 μl，于 37 ℃孵育 4-6 h，弃上清液，离心 5 min，弃培养液。每孔加 150 μl 的 DMSO 振荡 10 min，充分溶解结晶物。采用酶联免疫检测仪，于 490 nm 波长处检测光密度值(OD 值)，并计算细胞存活率 [细胞存活率=(葛根素组 OD 值-空白组 OD 值)/(对照组OD 值-空白组 OD 值)×100%]。

1.4 心肌细胞氧化应激指标的测定心肌细胞与不同浓度葛根素培养液共培养72 h，消化、洗涤后，收集各组细胞至2 ml EP管，冰浴。采用超声波裂解心肌细胞(功率600 w，超声5 s，间隙10 s，20次)。取各组细胞裂解液，应用考马斯亮蓝法检测蛋白浓度，按照试剂盒说明书处理样品，采用化学比色法测定SOD、T-AOC活力及MDA含量。

2 结果

2.1 不同浓度葛根素组心肌细胞的存活率与空白对照组(0 μg/ml)比较， 1、10、100 μg/ml 葛根素作用 24、48、72 h后存活率变化不明显，差异无统计学意义(P>0.05)；250 μg/ml葛根素组，心肌细胞的存活率下降，差异有统计学意义(P<0.05)。见表 1。

表1 不同浓度葛根素组心肌细胞的存活率

2.2 葛根素对心肌细胞SOD、T-AOC活力及MDA含量的影响0、1、10、100 μg/ml 葛根素组SOD、T-AOC活力呈剂量依赖性增高，MDA含量呈剂量依赖性降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。250 μg/ml葛根素组SOD、T-AOC活力及MDA含量与对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 葛根素对心肌细胞SOD、T-AOC活力及MDA含量的影响

3 讨论

线粒体中活性氧的种类增加可以引起线粒体DNA变异而损伤线粒体，最终导致细胞的衰老。细胞的衰老与线粒体过多的自由基、细胞的凋亡相关，因此探索能抗凋亡、清除细胞内自由基的天然药物对于抗衰老十分重要[5]。葛根素是一种黄酮苷，具有扩张心脑血管、降低心肌氧耗，改善微循环、抗血小板聚集等作用。已有研究表明，葛根素通过抑制高迁移率族蛋白 B1的释放，增加抗凋亡基因的表达，从而减少心肌梗死大鼠心肌细胞凋亡、改善心功能[6]。

有研究显示：葛根素对心肌具有保护作用，能够抗心肌细胞凋亡，减轻心肌细胞缺氧/复氧损伤[7-8]。翟毅[9]用葛根素干预大鼠心肌细胞H9c2，发现葛根素通过激活Akt蛋白来抑制阿霉素诱导的H9c2心肌细胞凋亡。葛根素预处理可提高缺血再灌注新生大鼠原代心肌细胞的活力，减少缺血再灌注损伤引起的活性氧生成、线粒体膜电位丧失、细胞坏死和凋亡[10]。本研究在参考以往研究基础上，将葛根素浓度范围设为0-250 μg/ml。结果显示：与空白对照组(0 μg/ml)比较， 1、10、100 μg/ml葛根素作用 24、48、72 h后存活率变化不明显；250 μg/ml葛根素预处理心肌细胞，其存活率下降，表明0-100 μg/ml葛根素预处理对心肌细胞较安全，250 μg/ml葛根素则浓度偏高，不利于心肌细胞生长。

活性氧是体内一类氧的单电子还原产物，是电子漏出呼吸链消耗2%的氧而生成[11]。活性氧的产生主要是线粒体呼吸链大量电子漏出并还原氧分子形成，是机体内由氧组成，含氧且性质活泼的物质的总称[12]。SOD是机体内一种抗氧化酶，在调节机体氧化-抗氧化系统中发挥重要作用。T-AOC反应各种抗氧化物质和包括SOD在内的各种抗氧化酶构成的总抗氧化水平。SOD和T-AOC分别从单个酶和总体水平反应细胞抗氧化水平。MDA则反应细胞的氧化水平，是自由基作用于脂质发生过氧化而生成的终产物。本研究结果显示：0、1、10、100 μg/ml葛根素组SOD、T-AOC活力呈剂量依赖性增高，MDA含量呈剂量依赖性降低。250 μg/ml葛根素组SOD、T-AOC活力及MDA含量与对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，提示0-100 μg/ml葛根素可增强心肌细胞的抗氧化水平。

综上所述，本研究结果表明0-100 μg/ml葛根素对原代大鼠心肌细胞较为安全，增强心肌细胞抗氧化应激水平。本研究尚存在一定局限性，如葛根素浓度梯度较小、作用时间较短等，将在后续研究中深入探讨。