烟草中活性氧的研究进展

刘家旺 范宁波 王爱霞 段玉锋 王廷贤 杨占伟

（1福建省烟草公司南平市公司，福建南平 353000；2河南农业大学烟草学院，河南郑州 450002；3河南中烟工业有限责任公司，河南郑州 450016；4云南省烟草公司曲靖市公司，云南曲靖 655001）

氧气是地球上绝大多数生物维持生命活动的必需物质之一，植物中的两大生理活动——呼吸作用和光合作用均离不开氧气参与[1]。然而，氧气参与这些生理活动往往会导致活性氧（reactive oxygen species，ROS）等副产物的产生。ROS主要包括超氧阴离子（O2-）、氢氧根离子（OH-）、羟自由基（·OH）、过氧化氢（H2O2）、单线态氧（1O2.）等物质[2]。 高浓度的活性氧会对生物产生一些害处，导致生物体氧化损伤并诱导细胞死亡[3]，甚至导致基因突变[4]；适宜浓度的活性氧可以激活某些酶以及转录因子[5]。因此，活性氧也可以作为生物体的信号分子[6]。生物体中的活性氧会被一些酶类物质清除，如 SOD、POD、CAT、APX等[7]。烟草（Nicotiana tabacum L.）属于茄科烟草属植物，是一种重要的经济作物[8]，在国民经济中占有重要地位。另外，烟草也是一种模式植物，在植物生命科学研究中发挥着十分重要的作用[9]。当烟草遭遇外界胁迫时，会积累大量活性氧物质[10-12]；烟叶在正常成熟发育过程中，也伴随着活性氧积累[13]；不同的田间处理会导致烟叶活性氧积累的差距[14-15]。鉴于烟草生产的特殊地位，本文主要综述了烟草中活性氧来源、活性氧功能以及一些常见的活性氧物质测定方法，以期为进一步研究烟草中活性氧提供一些参考。

1 烟草中活性氧的来源

1.1 非生物胁迫对活性氧的影响

1.1.1 干旱胁迫对活性氧的影响。水分是影响植物生长发育的重要因素，因而缺水干旱是影响植物生长发育最常见的因素之一。随着水资源逐渐匮乏，旱情频频发生[16]。烟草是对干旱胁迫较敏感的一种作物，如果植株没有得到充足的水分会导致一些生理障碍甚至死亡，严重影响烟叶生产。有研究发现干旱胁迫会导致烟草中活性氧物质的积累，导致膜脂过氧化，抑制植物的光合和呼吸等重要生理活动[17]，这可能是造成植物生理障碍的原因。王发展等[18]发现干旱条件能够导致H2O2、O2-含量显著增加；张 杰等[19]发现干旱条件使烟草幼苗中的H2O2和丙二醛（MDA）含量增加，使烟苗根系活力受阻。然而，外源施加5-氨基乙酰丙酸（ALA）、硫化氢（H2S）等物质均能有效缓解该症状。

1.1.2 温度胁迫对活性氧的影响。温度胁迫主要分为高温胁迫和低温胁迫。烟草起源于美洲地区，是一种喜温作物，对低温胁迫尤其敏感。低温胁迫会使烟草幼苗僵化、老化，大量研究表明，低温胁迫会导致烟草中活性氧的积累：顾开元等[20]用4℃低温处理烟草幼苗，发现经过低温处理的烟草幼苗中，其超氧阴离子和MDA含量明显升高；马晓寒等[21]发现低温处理的烟草幼苗中H2O2、O2-含量显著升高。高温胁迫也会导致活性氧积累，并能使清除活性氧的酶发生钝化：张 燕等[22]将烟草幼苗置于40℃高温下进行处理，发现热胁迫导致烟草叶片细胞膜系统显著受损，MDA和活性氧物质含量明显升高，叶片中叶绿素含量下降，SOD、CAT等抗氧化酶活性也随之改变，然而，外源CaCl2的使用能够有效改善这种不良状态。

1.1.3 金属离子胁迫对活性氧的影响。当今土壤污染严重，而金属离子的毒害是造成土壤污染的主要因素之一。刘 强等[23]发现，随着铝离子浓度升高，烟草叶片中O2-和H2O2含量均呈明显升高趋势，影响生物量积累，烟草中的铝毒害与叶片ROS积累成正相关。镉作为一种剧毒污染物，能够严重毒害动植物。烟草是一种可以富集镉离子的植物，吴敏兰等[24]通过盆栽试验研究了镉对翠碧1号、K326、云烟87等烟苗的影响，发现能够反映脂质过氧化作用强弱的重要指标MDA的含量都呈逐渐增加趋势，而POD、SOD等清除活性氧的酶类呈先增加后减少的趋势。在一定范围内，POD、SOD与活性氧的量成正相关，然而，随着镉添加量增加，叶片中超氧化物的量超过了酶类的清除能力，破坏了酶系统，抑制了酶活性。

1.2 生物胁迫对活性氧的影响

烟草在生长过程中会遭受多种生物胁迫，最为常见的是一些病虫害对烟草产生的胁迫作用，常见的有烟草普通花叶病毒病（TMV）、烟草黄瓜花叶病毒病（CMV）、烟蚜、烟青虫等病虫害[25-26]。 张 萍等[27]通过将辣椒脉斑驳病毒和黄瓜花叶病毒接种到烟草上，并利用NBT染色法和DAB染色法，分别来定性观察超氧离子和H2O2的产生和分布情况，发现病斑附近的染色较深，说明病毒侵染会导致烟草病斑附近活性氧的产生和积累[27]。当遭遇到害虫取食时，会通过产生ROS或钙信号等对害虫作出相应的抵御[8]。

1.3 烟叶自身成熟过程中活性氧的积累

烟叶成熟度被认为是影响烟叶质量的首要因素，也是保证和提高烤后烟叶品质及其工业可用性的前提条件[28-29]。我国烟叶与其他国家的优质烟叶相比，最明显的缺陷是烟叶成熟度不足，尤其是烟叶“上六片”成熟度不足，严重影响了国内上部烟叶的产量和质量[30]。在烟叶成熟过程中，活性氧逐渐积累，因而可以将活性氧作为衡量烟叶成熟度的指标。从烟叶的未熟阶段到适熟阶段，SOD和CAT活性下降缓慢，膜脂过氧化速度缓慢，活性氧积累少，在适熟期之后，膜脂过氧化速度显著提高，活性氧积累较多[31]。在烟草生命周期中，烟草植株需要进行呼吸作用和光合作用，而线粒体和叶绿体[32-33]是烟草活性氧的重要来源。叶绿体中产生的活性氧会导致叶片失绿和叶肉细胞死亡，从而导致叶片中的叶绿素含量降低，光合作用受到抑制，物质合成速度减慢，极大地影响了烟叶生长发育。线粒体是生物体进行呼吸作用的场所，线粒体上的许多位点都能产生活性氧。线粒体上所进行的有氧呼吸的产物大部分是水，但也有一小部分的产物是活性氧。活性氧会对线粒体造成严重损害，影响烟叶ATP合成，影响烟叶生命活动[34-35]。

2 活性氧在烟草中的功能

2.1 提高烟草的抗逆能力

活性氧系统并非只能给植物带来害处，也会对植物产生积极影响。有研究表明，适当浓度的活性氧可以作为信号分子诱导植物体防御基因的表达，增强植物对生物胁迫和非生物胁迫的抵抗能力。活性氧具有细胞毒性，是植物的一种自我保护机制。石永春等[36]通过对烟草品种K326喷施海藻糖水，发现海藻糖可能通过诱导烟叶中活性氧的产生，提高叶片中的H2O2含量，激活抗病基因表达而增强烟草对烟草花叶病毒（TMV）的抗病性。Abbink等[37]利用酵母双杂交技术，发现某种活性氧的相关基因不表达时，烟草花叶病毒量增加，这也在一定程度上证明活性氧参与了烟草的抗病性反应。鲁 琳等[38]发现，在遭遇盐胁迫时，烟草中活性氧清除相关基因的表达发生了显著改变。这些结果表明，活性氧的清除是花烟草抵御盐胁迫的重要机制之一。

2.2 参与烟草的信号转导

活性氧作为细胞中的第二信使，在植物生长发育过程中起着信号转导的作用，引导植物产生一系列生理生化反应[39]。王 宁等[40]利用外源H2O2处理烟草植株，导致烟草幼苗中的H2O2和O2-含量迅速增加，改变了烟草叶片和花芽的发育状况，表明烟草体内活性氧变化能够显著影响烟草发育进程。另外，ROS信号能够对植物中Ca2+有一定的调控作用，也能够作为信号分子刺激植物激素的合成和运输，进而控制植物生长发育[41]。

3 活性氧的测定方法

活性氧性质活泼，因而只能间接定量测定或者进行定性测定，活性氧的测定一般使用分光光度法进行定量监测，也可以使用染色法进行简便的定性监测。利用NBT（氯化硝基四氮唑蓝）光还原染色法可以测定超氧阴离子在生物体内的分布和相对含量，DAB（二氨基联苯胺）染色可以显示烟草体内H2O2的分布和大致含量[42]，可以利用荧光探针直接定量测定线粒体活性氧的形成[43]。活性氧难以直接测定，且测定过程和结果容易受到各种因素的影响，因而往往需要多个指标，如MDA和游离脯氨酸的配合。

4 结语

烟草作为一种可以影响国民经济的特殊经济作物，针对烟草的研究具有很大的实际应用价值。很多因素可以诱使烟草积累活性氧，高浓度的活性氧会导致植株衰老甚至死亡，然而适量浓度的活性氧会对植株产生一定的积极影响。目前，病虫害的危害已经成为阻碍烟草行业发展的一个重要因素[29]，而活性氧可以激活烟草的抗虫抗病机制。因此，关于活性氧的研究有助于了解植物抵抗病虫害的机制，并为烟草的抗虫抗病提供新思路[44]。